INMUNOHISTOQUÍMICA

INT. TEC.MED. ESP. EN LA LAB. CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGIA-

GRECIA MILAGROS FLORES LÁZARO
INTRODUCCIÓN
 FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS PARA LA
INMUNOHISTOQUIMICA

• Es una técnica que permite localizar moléculas en los tejidos mediante el

empleo de anticuerpos .
Para la técnica de inmunohistoquímica, serán
necesarios los
que sólo podrán obtenerse a través
de técnicas in vitro de una célula híbrida
llamada
 OBJETIVOS Y DEFINICIÓN DE LA
INMUNOHISTOQUÍMICA

• Aplicación de los inmunoensayos a las secciones tisulares.

• Localización inmunológica de proteínas en su medio ambiente natural. •
Evaluación simultánea de la morfología e identificación y localización de
proteínas dentro de las células y tejidos.
• Procedimientos analíticos diagnósticos empleados en la identificación
segura y caracterización de tipos tisulares en enfermedades neoplásicas y
no neoplásicas.
• ¿La inmunohistoquímica cuantifica?: No, la intensidad de la señal no
representa la cantidad real de proteína acumulada en el tejido.

La inmunohistoquimica
permite el estudio de tejidos
procedentes de biopsias,
autopsias y material
citológico.
ASPECTOS TÉCNICOS DE LA
INMUNOHISTOQUÍMICA
Anticuerpo a utilizar: Mono o
policlonal.
Material disponible: Fresco.
congelado o fijado en
Existen diversos tipos técnicas
formalina.
cuya indicación va a
depender de:
Antígenos a estudiar: de
superficie o membrana
citoplasmáticos o nucleares.
 El marcaje inmunohistoquímico se puede realizar
con fluorocromos (técnicas de
inmunofluorescencia), técnicas inmunoenzimáticas,
iones metálicos en forma coloidal (técnica de
inmuno-oro) o isótopos radioactivos.
FLUORESCENCIA
La fluorescencia es una forma de
luminiscencia entendiéndose ésta
última como la emisión de la luz que
se produce a partir de una fuente de
energía no térmica y bajo el efecto
de una excitación.
MARCAJE
INMUNOHISTOQUIMICO
ELISAS
El antígeno o anticuerpo estará marcado con
una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoabsorbente),añadiendo al final un
sustrato más una sustancia denominada
cromógeno, de tal manera que el producto de
la reacción actúa sobre el cromógeno dando
lugar a un precipitado insoluble, coloreado y
cuantificable en un espectrofotómetro o un
colorímetro.
Técnica inmuno-oro (ión
metálico en forma coloidal)
Gracias a la propiedad de las partículas
de oro para formar, en soluciones
salinas, complejos estables con
moléculas proteicas. Para conseguir
partículas de oro de diferentes tamaños
(5 a 20 nm), se manipula el pH de la
solución que lo contiene.
EXISTEN DOS TIPOS DE MÉTODOS
INMUNOHISTOQUÍMICOS:
 Método Inmunohistoquímico Directo

1. Método Inmunohistoquímico Directo:

En él, el anticuerpo específico contra la
sustancia que se quiere detectar está
marcado con partículas detectables al
microscopio (ej. Fluorescencia o
peroxidasa).
Los anticuerpos que son específicos
para una determinada proteína (o
grupo de proteínas) son inmovilizados
en un sustrato en fase sólida, como
gránulos microscópicos
superparamagnéticos o en gránulos
microscópicos de agarosa (no
magnético).
 Método Inmunohistoquímico Indirecto

2. Método Inmunohistoquímico Indirecto, en

él, la señal del anticuerpo se amplía
realizando sucesivas capas
de anticuerpos o marcadores (como son
Peroxidasa/Anti-Peroxidasa (PAP), Complejo
de Avidina Biotina peroxidasa (ABC).
Los anticuerpos que son específicos para una
determinada proteína, o grupo de proteínas,
se añaden directamente a la mezcla de
proteínas. Los anticuerpos todavía no se
hayan adheridos a un soporte en fase sólida.
Los anticuerpos son libres de flotar alrededor
de la mezcla de proteínas y aglutinar sus
objetivos
Método del Puente
Método del complejo peroxidasa anti-peroxidasa (PAP)
Método de la Fosfatasa Alcalina Anti-Fosfatasa Alcalina
Método del Complejo Avidina Biotina (ABC)
REACCIONES DEL
SUSTRATO
 1. Preparación de la muestra:

PROCESAMIENTO EN
INMUNOHISTOQUÍMICA
2. Fijación: Cada antígeno, dependiendo de su
localización histológica y anatómica, podrá fijar un
producto de forma distinta.

Para ello se habrá de tener en cuenta que:

Un exceso de fijador reduce la inmunoreactividad del

tejido.
El

y anatómica de dicho antígeno.

En muestras de gran volumen la fijación por inmersión
no convence ya que proporciona resultados variables
en cuanto a positividad inmunohistoquímica dándose
una mayor tinción en las zonas mejor fijadas.

La

Para acortar el tiempo de fijación puede utilizarse la

fijación por microondas.
 3. Descalcificación: un procedimiento de elección
para conservar mejor la inmunorreactividad tisular
es la utilización de EDTA.

4. INCLUSIÓN Permite obtener cortes finos y homogéneos, por lo que las piezas
a cortar deberán tener una determinada consistencia y uniformidad

5. Cortes y adhesivos: cortes en parafina las

secciones serán menos gruesas, entre 2 y 4 micras,
y se introducirán en una estufa durante un mínimo
de 20 minutos para que el corte de adhiera al
portaobjetos.
 6. Previo a la inmunotinción.

Kits universales de inmunohistoquímica:

Se denomina al conjunto de reactivos
utilizados en el proceso de inmunotinción,
hay muchos
(kit universal).
El 85% de los kits empleados son los de
estreptavidina-biotina-peroxidasa o fosfatasa
alcalina.
Los kits PAP se están usando menos por la
baja intensidad de la tinción y se están
sustituyendo por los FAAFA (fosfatasa-
antifosfatasa-alcalina).
Penetración de los reactivos. Detergentes: Los
detergentes se utilizan para aumentar la permeabilidad
de las membranas y que así los Ac puedan penetrar y
así alcancen a los Ag a detectar.

Bloqueo de la tinción de fondo: La tinción de fondo

se trata de uno de los principales problemas de la
técnica inmunohistoquímica. Se define como toda
tinción que aparece allí donde no debería haberla.
Existen dos tipos de tinción de fondo:
ESPECÍCAS E INEPECIFICAS
Bloqueo de la actividad enzimática endógena: Se
trata de un método por el que se consigue inhibir la
actividad enzimática. El método más usado para este
bloqueo es la incubación de las secciones antes del
proceso inmunológico, aplicando algún agente
bloqueante específico en cada caso.

Desenmascaramiento antigénico o recuperación

antigénica: Los tejidos llegan casi todos al laboratorio
fijados en formalina e incluidos en parafina, la fijación
en soluciones que contengan formaldehído pueden
causar reacciones cruzadas en las proteínas y la
inclusión en parafina alterar la forma de las proteínas.
 RECUPERACIÓN ANTIGENICA
Digestión enzimática
• La digestión enzimática
induce una rotura de
enlaces cruzados que
facilita el acceso del
anticuerpo primario al
antígeno
• Los procesos varían de
acuerdo a los laboratorios,
la fijación de los tejidos, el
tipo de anticuerpo y los
antígenos estudiados
Recuperación térmica
• La recuperación antigénica
o recuperación de epítopo
inducida por calor
• La mayoría de los
anticuerpos se benefician
de la recuperación térmica,
especialmente los que
detectan proteínas
nucleares
 7. La inmunotinción propiamente dicha

Diluciones de los anticuerpos, lavados e

incubaciones: Cuando se diluye por
primera vez un Ac o, aunque sea
conocido, si se usa por primera vez
sobre un tejido problema, hay que hacer
pruebas de ensayo para evitar errores
posteriores

Coloraciones de contraste: A fin de

reconocer mejor los tejidos se emplean
coloraciones (cromógenos) para diferir
las áreas tisulares inmunoteñidas de las
que no lo han sido.
 APLICACIONES DE LA HISTOQUÍMICA
Ejemplos de marcadoresinm nohistoquímicos
Anticuerpo Células/antígenos detectados
CD1a Célula de Langerhans
CD4 Linfocito T de auxilio
CD8 Linfocito T citotóxico
CD30 Célula de Reed-Sternberg
CD45 Leucocitos
CD68 Macrófagos
S100 Células de Schwann
HMB-45 Melanocitos
AE1 Citoqueratinas de bajo peso
molecular
AE3 Citoqueratinas de alto peso
molecular
DESMINA Células musculares
GFAP Glía
CEA Antígeno carcino-embrionario
AFP Alfa-fetoproteína
REN Receptores nucleares de estrógenos

VIM Sarcomas