PROTEÍNAS PROTÉICA PROTEÍNA E DNA/RNA? VANTAGENS DA ELETROFORESE
Separa às macromoléculas (proteínas e ácidos
nucléicos), os quais possuem diferentes tamanhos, carga ou conformação. QUE INFORMAÇÕES A ELETROFORESE FORNECE AO PESQUISADOR?
Peso Ponto molecular da isoelétrico da proteína proteína
Propriedade Extremamente Importante de Uma proteína.
ELETROFORESE: A TÉCNICA • Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo oposto ao da sua carga. Proteínas (Torna-se uma molécula com carga líquida negativa -SDS) e DNA sempre negativa . • Eletroforese ocorre dentro de um gel. • O GEL DE ELETROFORESE: AGAROSE
• Agarose: é um polissacarídeo extraído de alga
marinha. Usada em concentrações de 0,5 to 2%.
• Fácil de preparar. Não-tóxico.
• Géis de Agarose possuem ampla capacidade de
separação, dependendo da concentração do gel podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese. • O GEL DE ELETROFORESE: POLIACRILAMIDA
• Poliacrilamida: polímero de ligação cruzada de acrilamida. O
Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3,5 a 20%). São mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro.
. Para DNA a poliacrilamida é usada para separar fragmentos
de menos de 500 bp. Às vezes podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença. O GEL DE ELETROFORESE: ACRILAMIDA
• Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser
manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre. • O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar, e também para manter o pH mais ou menos constante. ELETROFORESE: RESUMO DA TÉCNICA • O gel é então analisado, e permite ao pesquisador: • Determinar Peso Molecular e/ou ponto isoelétrico de proteínas. • Permite ao Pesquisador estimar rapidamente o número de proteínas distintas em uma mistura • Identificação de polimorfismos em DNA’s teciduais. • Estudos variados dos ácidos nucléicos • avaliar o grau de pureza de uma amostra protéica após purificação.