Kuantitatif FTIR (Fourier Transform Infrared)

• Sinar inframerah dilewatkan dalam

sampel.
• Gelombang diteruskan, dan ditangkap
oleh detektor.
• Komputer akan memberikan gambaran
spektrum sampel.
• Struktur kimia dan bentuk ikatan
molekul sampel menjadi dasar bentuk
spektrum yang diperoleh.
Metode Biuret
• Reaksi biuret merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptida (-
CO-NH-N) dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna
ungu karena terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul
ikatan peptida.
• Prinsip penetapan kadar protein dalam serum dengan metode Biuret
adalah pengukuran serapan cahaya kompleks berwarna ungu dari protein
yang bereaksi dengan pereaksi biuret dimana, yang membentuk kompleks
adalah protein dengan ion Cu2+ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam
suasana basa.
• Semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap oleh alat maka semakin
tinggi pula kandungan protein yang terdapat di dalam serum tersebut.
Cara analisis :
• Pembuatan kurva standar
• Penetapan sampel
• Pengukuran dengan spektrofotometri
• Perhitungan
Metode Lowry
• Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi
lain (Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine
dan tryptophan dalam protein.
• Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara
500 – 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan.
• Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan
untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah
puncak besar disekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk
menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah.
Metode Bradford
• Ikatan Coomasie Blue G250 dengan
protein menyebabkan perubahan
absorbsi maksimum reagen dari 465
nm (merah) menjadi 595 nm (biru)
pada larutan asam.
• Reagen ditambahkan kepada sampel,
dan absorbansi diukur pada 595 nm.
• Semakin banyak konsentrasi protein,
semakin intens warna biru yang
terjadi.
Metode Kjeldahl
• Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk
penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa
yang mengandung nitrogen.
• Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan
komponen organic dalam sampel didestruksi dengan
menggunakan asam sulfat dan katalis.
• Hasil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali
dan melalui destilasi.
• Destilat ditampung dalam larutan asam borat. Selanjutnya ion-
ion borat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl.
Uji Ninhidrin
• Uji Ninhidrin atau tes ninhidrin
digunakan untuk menunjukkan adanya
asam amino dalam zat yang diuji .
Dalam uji ini digunakan larutan
ninhidrin untuk mendeteksi semua
jenis asam amino. Ninhidrin
merupakan senyawa kimia yang
digunakan untuk mendeteksi gugus
amina dalam molekul asam amino.
Uji Xantoproteic
• Pereaksi xantoprotein adalah larutan asam nitrat pekat. Jika larutan
HNO3 pekat dimasukkan ke dalam larutan protein secara hati-hati,
akan terbentuk endapan putih, dan berubah menjadi kuning jika
dipanaskan. Hal ini disebabkan nitrasi pada inti benzena yang
terdapat dalam protein. Pereaksi xantoprotein positif terhadap
protein yang mengandung asam amino dengan gugus samping fenil,
seperti asam amino tirosin, fenilalanin, dan triptofan.
Uji Pauly’s Diazo
• Terjadi proses diazotization karena adanya sodium nitrite dan
hydrohydrochloric acid, dan menghasilkan garam diazonium. Garam
diazonium membentuk pasangan dengan tirosin atau histidin pada
medium basa untuk menghasilkan warna merah.
Western Blothing
Meliputi 3 hal, yaitu:
• Pemisahan berdasarkan ukuran protein.
• Perpindahan protein ke membran.
• Menandakan protein target dengan menggunakan antibodi primer
dan sekunder
LC-MS
Kristalisasi X-ray
• Kristalografi sinar-X menggunakan pancaran
sinar-X yang ditembakkan mengenai suatu
protein yang telah dimurnikan atau memiliki
kemurnian tinggi sehingga berbentuk kristal.
• Sinar X-ray dapat berinteraksi dengan
elektron di sekitar molekul protein dan
memantul.
• Menggunakan model dan persamaan
matematika untuk mengkontruksikan hasil
difraksi menjadi bentuk 3D.
• Dibutuhkan protein sangat murni dalam
bentuk kristal dengan jumlah banyak.
Spektroskopi NMR
• NMR bekerja berdasarkan prinsip jika nuclei
dari beberapa elemen atom seperti
hidrogen, akan beresonansi saat sebuah
molekul, seperti protein, ditempatkan pada
medan magnet kuat.
• NMR mengukur perubahan kimia pada nuclei
atom pada protein, yang bergantung pada
atom di sekitarnya dan jarak dengan atom di
sekitarnya.
• NMR akan mnghasilkan data berupa
kemungkinan struktur yang terjadi, bukan
sebuah struktur. Untuk protein kecil, NMR
dapat secara akurat memprediksi strukturnya
secara tiga dimensi.
 Mikroskopi Elektron

• Sinar elektron digunakan untuk menggambarkan

molekul secara langsung.
• Hasilnya berupa gambar 3D.
• Difraksi elektron digunakan untuk memetakan densitas
3D.
• Metode mikrografi elektron sering digabung dengan
kristalisasi X-ray atau spektroskopi NMR.
• Metode ini telah terbukti berguna untuk struktur
multimolekular seperti ribosom, tRNA, dll.
CD Spektroskopi
• Spektroskopi Circular Dichroism (CD) mengukur perbedaan antara
penyerapan cahaya yang terpolarisasi tangan kiri versus cahaya
terpolarisasi takan kanan yang muncul akibat struktur yang asimentri.
• Spektrum CD dari protein pada daerah spektrum “near-UV” (250-350
nm) akan sensitif pada beberapa aspek struktur tersier. Pada panjang
gelombang sebesar ini, chromophoresnya adalah asam amino
aromatic dan ikatan disulfide, dan sinyal CD yang dihasilkan akan
sensitive pada struktur tersier protein secara keseluruhan.
• Sinyal pada daerah spectrum dari 250-270 nm akan cocok dengan
residu phnylalanine, sinyal pada daerah 270-290 nm akan
menunjukan tirosin, 280-300 akan cocok dengan atribut tryptophan.