CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE

ALTA PERFORMANCE
(HPLC)
 TEMA VII: SEPARACIONES ANALÍTICAS.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE.
.
Clasificación de cromatografía líquida. Términos
básicos y definiciones: constante de distribución,
factor de capacidad, altura equivalente del plato
teórico, tiempo muerto, tiempo de retención,
factor de selectividad, resolución. Tipos de fases
estacionarias y móviles. Variables para la
optimización de la separación. Cromatografía en
fase normal y reversa. Elución isocrática y en
gradiente. Componentes del equipo.
Preparación de eluyentes y muestras. Análisis
cualitativo y cuantitativo. Aplicaciones.
1ra clase
CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es una técnica separativa mediante la cual

dos o más componentes de una mezcla se separan mutuamente
en función de sus afinidades diferentes en dos fases inmiscibles
entre sí:

1.- fase estacionaria: sólida o

líquida (adherida a un
soporte sólido)

2.- fase móvil: gas o líquida

 TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

EN PLACA EN COLUMNA

sólido
sólido
FASE
ESTACIONARIA líquido adsorbido o ligado
líquido adsorbido
sobre un sólido
un sólido

FASE MÓVIL líquido gas líquido

ANALITO líquido gas líquido

líquido volátil
CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA
GASEOSA LÍQUIDA
¿QUÉ SIGNIFICA HPLC?
 HPLC:
FASES ESTACIONARIAS Y EQILIBRIOS DE SEPARACIÓN

Tamaño de partícula extremadamente pequeño: Ø medio: 5 - 50 

SÓLIDO (sílica gel, alúmina, carbón): LSC
equilibrio de adsorción en sitios polares definidos del
sólido (fase estacionaria) que interactúan con los ..
grupos funcionales polares del soluto
..
H-O-Si

LÍQUIDO (unido a soporte sólido): LLC

equilibrio de partición entre dos fases líquidas inmiscibles fm fs
entre sí, estando la fase estacionaria ligada químicamente
al soporte sólido.

polar: fase normal

Fase estacionaria
no polar: fase reversa
SÓLIDO (gel o sólido inorgánico poroso): Cromatografía de exclusión
por tamaño o permeación
En este caso, la fase estacionaria es inerte,
y la separación se produce por avances y retardos
diferentes en la fase móvil, dentro y fuera de los poros.

SÓLIDO (resina porosa) con grupos iónicos ligados:

equilibrio de intercambio iónico
- La fase móvil es generalmente una solución buffer que contiene un
+ ]
contraión de carga opuesta al del grupo ligado al soporte, en un
+ + estado de equilibrio de cargas. La retención se debe a la
+ competencia del soluto con el contraión por el sitio activo.
_
LÍQUIDO (unido a soporte sólido como fase reversa): cromatografía de
-
par iónico.
El analito forma un par iónico con un contraión en la fase móvil, que puede particionar
con la parte lipofílica de la fase estacionaria (A), o bien el contraión se carga sobre la
fase estacionaria y actúa como intercambiador iónico (B).

Si Si
O RCOO- + SO3-
N +NH
(B) 3R
(A) R4 R3
MICROFOTOGRAFÍA DE PARTÍCULAS DE SÍLICE
DE RELLENO DE COLUMNA
FASES ESTACIONARIAS FIJADAS QUÍMICAMENTE

Flujo fm
MECANISMO DE CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO

Partícula del empaque

Fase móvil
A
La muestra sembrada
contiene moléculas
B B de distinto tamaño
poros
Inyección C
Las moléculas pequeñas
C se retienen en los poros
Tiempo de retención
y las grandes salen con
el eluyente
ESTRUCTURA DE RESINA DE INTERCAMBIO
IÓNICO DE POLIESTIRENO ENTRECRUZADO

o bien:

-COO- H+

-NH3+ OH-

-N(CH3)3+ OH-

11
ELECCIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA en HPLC
ELUCIÓN EN COLUMNA
El flujo de fase móvil, en términos de parámetros de la columna,
puede escribirse como:
 PARÁMETROS DE UN CROMATOGRAMA

Ancho de pico a mitad de altura = Factor de simetría del pico = A / B

ancho medio de pico = W/2

La altura del
El ancho de pico
Inyección de muestra

pico está dada

está dado por la por la distancia
distancia entre entre la línea
las intersecciones base (a W/2) y la 10 % de la
de las tangentes intersección con altura
con la línea base: W el pico.

frente del pico a 10% de altura

cola del pico a 10% de altura
Tiempo de retención de:
Frente del
solvente
(sustancia
no retenida) Pico de la 1ª sust. eluida
Pico de la 2ª sust. eluida

15 13
DESVIACIÓN STANDARD DEL TIEMPO DE RETENCIÓN

fm

fs

-2σ(t) +2σ(t)

W = 2 * 2σ(t) = 4*σ(t)
 PARÁMETROS de INTERÉS CROMATOGRÁFICO
[ X ]s
Coeficiente de distribución K K K es constante en un amplio intervalo de concentración
[ X ]m de soluto. Indica la afinidad del soluto por ambas fases.
Tiempo de retención total tR1 o tR2 : el tiempo necesario para que una sustancia llegue desde el punto de
inyección de muestra hasta el detector.

Tiempo muerto t0 : el tiempo necesario para que una sustancia inerte, no retenida por la columna,
llegue desde el punto de inyección hasta el detector. Equivale al frente de solvente.

Tiempo de retención neto: t R1  t R1  t0 o t R2  t R2  t0 Es el tiempo que el compuesto

permanece retenido por la fase estacionaria.

t R 1  t0 t  t0
Factor de capacidad: k1  o k 2  R 2 Es la medida de la posición del pico de una
t0 t0
sustancia en el cromatograma, característico de la sustancia para esa corrida.

k2
Factor de separación  :  donde k1 es de una sustancia de referencia o la más próxima.
k1 El valor de  no depende de la longitud de la columna,
ni de su empaque, ni del espesor de la fase estacionaria.

L
Velocidad lineal del eluyente: u
t0 Es el cociente entre la longitud de la columna y el tiempo
muerto; es independiente del diámetro de la columna.
 PARÁMETROS de INTERÉS CROMATOGRÁFICO

1: Parámetros de retención

2: Retención relativa 3: Eficiencia

La retención relativa de dos solutos, α, donde

1 eluye antes que 2, es:

α depende de la naturaleza de la fase móvil y

estacionaria y de la temperatura de la columna.
Siempre se debe tener cuidado en elegir el mejor
par de fases para separar los solutos más
próximos, los más difíciles de separar
 5: Resolución
4: Asimetría

Para relacionar las condiciones de la corrida con la

resolución, o la forma de mejorarla, las ecuaciones deben
plantearse en términos termodinámicos y cinéticos de
sistema.
/
(𝑡𝑟2−𝑡𝑟1) 𝑁1 2 1−𝑡𝑟1
𝑅= N1/2 = ( )
El coleo puede muchas veces ser atribuido 4𝑡𝑟2 4 𝑡𝑟2
a una mala combinación soluto-fs , La retención relativa α es igual a k´2/k´1,
solucionándose cambiando la columna. resultando la ecuación fundamental
En CLS o iónica, el problema más común
es el carácter heterogéneo de los sitios de La Resolución queda
retención debido la no equivalencia entre expresada como producto
los mismos lo que resulta en sitios de de tres factores:
distinta afinidad. Si estos sitios no están 1.- la selectividad de la
sobrecargados, la banda eluye con forma columna, que varía con α
normal. Otra posibilidad es eliminar
2.- la velocidad de
selectivamente estos sitios más fuetes
CADA FACTOR PUEDE SER migración o factor de
incluyendo un componente desactivante
CALCULADO DIRECTAMENTE capacidad (tomado como
en la fase móvil.
A PARTIR DEL CROMATOGRAMA k´2 o el valor medio de
Una columna mal empaquetada o una
ambos
mala inyección pueden producir picos
asimétricos. 3.- la eficiencia , que
depende de L/H (ó N)
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS Y RELACIONES ENTRE ELLOS

Velocidad lineal de la fase

móvil Asociado a los parámetros de ajuste
para el sistema particular
Volumen de la fase móvil

Asociado a retención
Factor de capacidad (variables con la fase móvil)

Medida de la afinidad
Constante de distribución del soluto con ambas fases

Factor de selectividad
Medida de la separación
entre analitos
(proceso termodinámico)
Resolución

Número de platos teóricos Medida cuantitativa

de la eficiencia
(proceso cinético)
Factor de capacidad

Tiempo de retención
 FORMAS DE PICOS CROMATOGRÁFICOS

tiempo

Ideal
ideal ancho fronteo coleo doble negativo

Causa: Causa:
Causa: Causa:
Concentración Causa: Canal a la cabecera
Volumen excesivo Problema
excesiva del analito: Más de un meca- de la columna o
de muestra y/o de
la capacidad de la nismo de retención presencia de
eluyente demasiado detección.
columna del analito. interferente.
fuerte.
está excedida.
CAPACIDAD DE CARGA DE UNA COLUMNA

k´= K Vs/Vm

K = [X]sVs/[X]mVm
2da clase
RELACIÓN ENTRE LA ALTURA DE PLATO TEÓRICO
Y LONGITUD DE COLUMNA
PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA EFICIENCIA H eff
fm
• Transferencia de masa en fs fs
• Transferencia de masa en fm estanca
• -Δ el camino difusional (dporo o dpartícula)
• Δ la velocidad de difusión
Aumenta (-Δ viscosidad)
si: • -Δ el espesor de la fs
• -Δ k´ para que pase menos t en fs

• El movimiento en fm es complejo debido

• Transferencia de masa del soluto en fm al empaquetamiento
• Se minimiza con:
a) empaquetamiento compacto
b) canales pequeños
c) solventes poco viscosos

• Difusión aleatoria • Difusión longitudinal pro y anti sentido

(flujo irregular entre partículas del flujo de fm :
debido a tortuosidad a) importante en LGC
y grado de constricción ) b) apreciable en LLC a bajas u
 PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA EFICIENCIA
ECUACIÓN DE van DEEMTER

Término Relación con las

Variables
Proceso de la ecuación propiedades del
involucradas
van Deemter analito y la columna

: cte; depende de la
calidad del relleno
Camino múltiple A A = 2dp
dp: diámetro de la
partícula

B: coeficiente de difusión
longitudinal
DM: coeficiente de
Difusión difusión en la fase móvil
B/u B/u = 2gDM/u
longitudinal g: factor de obstrucción,
cte; depende de la
calidad del relleno

CS: coeficiente de
transferencia de masa en
fase estacionaria
Transferencia de fS(k´): término en H = A + B/u + (CS + CM)u
masa en la fase función de k´ para la fase
CSu CSu = (fS(k´)df2/DS)u estacionaria
estacionaria
df: espesor de fase
líquida estacionaria
DS: coeficiente de
difusión en la fase
estacionaria

CM: coeficiente de
transferencia de masa en
Transferencia de fase móvil
masa en la fase CMu CMu = (fM(k´)dp2/DM)u fM(k´): término en
función de k´ para la fase
móvil móvil
DM: coeficiente de
difusión en la fase móvil
 SEPARACIÓN DE PICOS CROMATOGRÁFICOS:
RESOLUCIÓN

2(tRB  t RA )
Rs  >1
WB  W A
Rs = ¼  N (α – 1 ) ( k´ )
α 1 + k´

eficiencia capacidad

selectividad

Aumento de α, N y k´ (media entre dos bandas

adyacentes)
• favorece la resolución
• aumenta el tiempo de corrida
Se deben mejorar α y k´ por variación
del tipo de fase móvil
(o eventualmente estacionaria)
 SEPARACIÓN DE PICOS CROMATOGRÁFICOS

t0
Señal
α = constante
-∆ W
t0 +∆ N +∆ eficiencia
-∆ H

+∆ W
t0 -∆ N -∆ eficiencia
+∆ H
+ΔtR2 ∆ α selectividad

t0
k´ bajo; se debe disminuir el tamaño de partícula, o
aumentar el volumen de fase estacionaria o aumentar
la longitud de la columna, o ∆α (selectividad) por
tiempo
variación(minutos)
de la composición de la fase móvil.
 OPTIMIZACIÓN DE CROMATOGRAMA

falla objetivo
Gráfico de Van Deemter
Para aumentar la eficiencia 10 
(por disminución de W y aumento de
N) se puede:
• aumentar la longitud de la 5
columna (cambio de columna) c
• disminuir el tamaño de las H
partículas del empaque (cambio
de columna)
• disminuir el caudal de la fase
móvil (operacional) A
• disminuir el volumen muerto
extra-columna (operacional)

• Dado que RS es proporcional a N ½, se requieren variaciones grandes de N

para modificar la resolución.
 OPTIMIZACIÓN DEL CROMATOGRAMA
t R1  t R 2
k
2

falla objetivo

k es el promedio de los
parámetros de retención de
dos picos adyacentes.
• 0< k <1 se afecta
severamente la RS
• 2<k <10 buena RS Óptimo: 2 - 10

• k = 20 poco aumento de RS

• Un aumento de k mejora la resolución a costa de mayor tiempo de análisis

• Lo usual es variar la retención relativa de los solutos por cambio de la fuerza
de la fase móvil
 OPTIMIZACIÓN DEL CROMATOGRAMA

α = tR2/tR1

falla objetivo
Log Nef

Cuando los picos están

muy juntos (α → 1) se debe
modificar el factor de
selectividad α cambiando la
composición de la fase móvil
para diferenciar los
respectivos tR, o
eventualmente la fase RS=1,5
estacionaria.
RS=2,0
pH y T pueden ser otras
variables de control. α
 SITUACIÓN DE COMPROMISO
CROMATOGRÁFICO

RESOLUCIÓN

HPLC

VELOCIDAD CAPACIDAD

31
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
FUERZA DE LOS SOLVENTES

Con un eluyente débil, el

fenol permanece retenido.

Un eluyente más fuerte, como

un éter, desplaza al fenol.

1.- Se elije un solvente con polaridad similar al

soluto más polar
2.- Si k´es muy pequeño (eluye muy rápido),
se elije un eluyente menos polar.
3.- Si el tiempo de elución es muy alto,
se elije un eluyente más polar.

Un aumento de ε0 en 0,05 unidades produce

una variación de k´ de 4 ó 5
 FUERZA DE SOLVENTES EN MEZCLAS BINARIAS

Utilizar una mezcla binaria de solventes puede mejorar la selectividad por variación de las
fuerzas dipolares o las características protón-aceptor o protón-donor.
La presencia de un éter en una fase móvil constituída por una mezcla binaria provee
sitios donores para puentes hidrógeno, ya sea con los centros adsorbentes o con las
moléculas de un soluto, lo que varía significativamente el factor de separación.
POLARIDAD Y MISCIBILIDAD DE SOLVENTES

34
 CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
FUERZA DEL SOLVENTE

Cromatografía fase normal Cromatografía fase reversa

Se utilizan solventes de baja polaridad, Se utilizan fases móviles de alta polaridad,

RH ó RH modificados por el agregado de (ε0 altos).
1 ó 2% de algún solvente más polar, que
Tipo de Relleno de

POLARIDAD
satura los sitios más activos. muestra columna
Fase móvil
baja/moderada
polaridad
C-18
Fases estacionarias: (soluble en
químicamente ligado
metanol / agua
hidrocarburos
* funciones ciano (polaridad media) alifáticos)
-CH2CH3CN moderada
polaridad C-8

POLARIDAD
* fenil silano (interacciones -) (soluble en metil- químicamente ligado
acetinitrilo / agua
etil cetona)
*amino alquil (polaridad alta)
-N(CH3)2 alta polaridad
(soluble en
C-2
1-4 dioxano / agua
químicamente ligado
alcoholes livianos)

Elución isocrática: utiliza una única fase móvil durante toda la corrida,
ya sea un solvente puro o una mezcla de composición definida:
la fuerza del solvente (ε0 ) es constante en toda la experiencia.
EFECTO DE LA COMPOSICIÓN DEL ELUYENTE
SOBRE LA EFICIENCIA DE LA SEPARACIÓN

1: 9,10-antraquinona

POLARIDAD
2: 2-metil-9,10-antraquinona
3: 2-etil-9,10-antraquinona
4:1,4-dimetil-9,10-antraquinona
5: 2-t-butil-9,10-antraquinona
 CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
Si aumenta la longitud de la cadena del siloxano →disminuye la polaridad de fs
Se aumenta la eficiencia de la separación (ΔtR → ΔN)
Se aumenta la selectividad de la separación (Δα)
Se aumenta el tiempo de análisis

Ø=5

Eluyente: Metanol / agua = 50/50

Caudal: 1,0 mL/min

37
ELUCIONES ISOCRÁTICA Y CON GRADIENTE
Elución con gradiente: la fuerza del solvente se varía en el tiempo de la corrida
por variación de ε0 debido a la mezcla en forma continua de hasta tres solventes
en la forma que resulte conveniente, con el objeto de mejorar la resolución
(variación de k´ y α ) o los tiempos de corrida cromatográfica.
ELUCIÓN CON GRADIENTE DE COMPOSICIÓN DE
ELUYENTE
 CROMATOGRAFÍA IÓNICA:
MEMBRANA SUPRESORA DE CONDUCTIVIDAD

Tipo de Cromatografía Cromatografía de

cromatografía de intercambio aniónico intercambio catiónico
Base catiónica Base aniónica
Eluyente HCl (H+ + Cl-) NaHCO3(Na+ + HCO3-)

H++ Cl- + Resina+OH- Na + HCO3 + Resina- H+

+ -
Membrana -
→ Resina+Cl- + H2O → Resina Na+ + H2CO3
intercambiadora
3ra clase

EQUIPO DE HPLC CON PROGRAMADOR

DE GRADIENTE DE ELUCIÓN
BOMBA IMPULSORA RECÍPROCA
RULO DE INYECCIÓN DE MUESTRA

Volumen fijo inyectado: 10-100 µL

VÁLVULA ROTATIVA DE INYECCIÓN DE MUESTRA

(a) ciclo de carga (b) ciclo de inyección a la columna

 FILTRACIÓN DE MUESTRA POR MEMBRANA

MATERIAL: se elije de acuerdo a su estabilidad en la fm utilizada

 nitato de celulosa
 acetato de celulosa
DIÁMETRO DE PORO: 0,2 – 0,5 µm
DETECTORES USADOS EN HPLC

46
DETECTOR ELECTROANALÍTICO
 DETECCIÓN ABSORCIOMÉTRICA
CON ARREGLO DE DIODOS

Espectros de absorción del eluido de la columna tomados a intervalos de 5 segundos, para una mezcla
de tres esteroides; a partir de los datos espectrales, se puede identificar las especies y elegir las
condiciones operacionales para su determinación cuantitativa.
CROMATOGRAFÍA IÓNICA CON
DETECCIÓN ABSORCIOMÉTRICA
DETECCIÓN REFRACTOMÉTRICA
 CURVA DE CALIBRACIÓN
PARA COLUMNA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO