Anda di halaman 1dari 54

Teknik Kuantifikasi

Menggunakan Zat Standar

Fajar Nugraha, M.Sc., Apt.


Setujukah Anda Dengan Teknik
Perhitungan Kadar
Obat
Tanpa Menggunakan
Standar
???

PERHIT. KDR 2
Teknik Kuantitasi

Untuk pembuatan Kurva baku,


yang akan digunakan untuk perhitungan
kadar zat dalam sampel
dapat
digunakan berbagai macam teknik standar

Teknik:
Standar Eksternal
Standar Internal
Standar Adisi
TNK STD 3
Standar Eksternal

TNK STD 4
Standar Eksternal
- Senyawa yg digunakan sama dengan senyawa
yg dianalisis dalam sampel

- Dipersiapkan dan dianalisis secara terpisah


dari sampel

- Penggunaan standar eksternal lebih disukai


pada kebanyakan sampel HPLC dan
Spektrofotometri yg tidak memerlukan tahapan
panjang penyiapan sampel

TNK STD 5
Standar Eksternal

Misal
 Penetapan kadar Parasetamol dalam tablet,
secara Spektrofotometri UV  digunakan
standar baku Parasetamol

 Penetapan kadar Asam mefenamat dalam


darah secara HPLC-UV  digunakan standar
baku Asam mefenamat
TNK STD 6
Plot Standar Untuk Kuantitasi
 Dalam beberapa contoh di industri farmasi,
produk obat dibuat dengan berbagai kadar,
misal:
Tablet Methyl Prednisolon
dengan kadar: 4 mg, 8 mg, 16 mg

Untuk keperluan
mengembangkan dan memvalidasi metode
penetapan kadarnya,
dapat ditempuh tiga strategi:

PERHIT. KDR 7
1. Single-Point Calibration
 Digunakan satu macam konsentrasi standar

 Plot standar yang dibuat, digunakan untuk


menetapkan semua kadar tablet

 Hal yang perlu diperhatikan adalah:


- metode ini perlu skema pengenceran dan
ekstraksi yang berbeda untuk kadar obat yang
bermacam-macam tersebut, dengan target:

Mendapatkan konsentrasi akhir serupa


yang mendekati konsentarsi standar yang dibuat
[ Respon Berdekatan ]
PERHIT. KDR 8
Perbandingan Absorban

Absorban sampel
x Kadar baku = Kadar sampel
Absorban baku

Syarat:
Nilai Abs.baku dan Nilai Abs.sampel
berdekatan

PERHIT. KDR Chan dkk., 2004, p.14. 9


2. Multiple-Point Calibration
 Digunakan seri konsentrasi standar yang dapat
mengkover semua kadar produk obat tersebut.
 Pada rentang konsentrasi tersebut, responnya
harus linear.
 Respon seluruh kadar obat (larutan akhir yang
akan dibaca) berada pada rentang respon
kurva kalibrasi.

Syarat:
Tidak diperbolehkan adanya Ekstrapolasi
KENAPA??
PERHIT. KDR 10
PERHIT. KDR 11
3. One Standard Calibration
for Each Strength

Digunakan satu konsentrasi standar


untuk
setiap kadar obat

Kapan Metode ini dipilih ?

Apabila analit tidak menunjukkan linearitas pada


rentang konsentrasi yang layak

PERHIT. KDR 12
Bagaimana Menghitung Kadar
 Dengan perbandingan nilai absorban sampel
terhadap nilai absorban baku [yang sudah
diketahui kadarnya]

Apa yang harus diperhatikan ?

 Dengan menggunakan kurva baku/persamaan


garis regresi linear.

Apa yang harus diperhatikan ?

PERHIT. KDR 13
Linearitas [ Menurut ICH, Q2(R1) ]
Chan dkk., 2004, p.14.

Linearitas
suatu metode analisis:

adalah kemampuan metode tersebut


(pada rentang tertentu)
untuk mencapai hasil uji yang berupa
variasi data
(misal: absorban, luas area kromatogram)
yang secara langsung proporsional terhadap
konsentrasi analit dalam sampel
PERHIT. KDR 14
Linearitas (lanjutan)

 Variasi data yang digunakan untuk meng-


kuantifikasi analit dapat berupa:
- luas area kromatogram
- tinggi puncak kromatogram
- rasio antara luas area (tinggi puncak)
kromatogram analit terhadap luas area
(tinggi puncak) kromatogram standar
internal

PERHIT. KDR 15
Kuatitasi Analit
 Tergantung pada kepatuhan pemenuhan
hukum Beer
 Tergantung linearitas pada rentang konsen-
trasi tertentu

 Oleh karenanya:
- konsentrasi sampel kerja dan sampel yang
diuji untuk akurasi harus pada rentang yang
linear
.

PERHIT. KDR 16
Linearitas
 Biasanya dipersiapkan langsung dengan
pengenceran larutan baku stock.

 Disarankan linearitas dikerjakan dengan seri


pengenceran larutan stock.

 Tidak disarankan mempersiapkan seri konsen-


trasi larutan baku dengan seri penimbangan
zat standar, Kenapa ? karena:

Terjadi kesalahan penimbangan


Tidak menjamin diperolehnya linearitas yang baik
PERHIT. KDR 17
Evaluasi Linearitas
 Paling baik dilakukan dengan pengamatan
secara visual plot respon (signal) sebagai
fungsi konsentrasi analit.

 Selanjutnya, variasi data umumnya digunakan


untuk menghitung persamaan garis regresi
dengan metode kuadrat terkecil ( Y = b X + a )

Syarat Linearitas:
Coeffcient of determination ( r2 ) ≥ 0.997

PERHIT. KDR 18
lanjutan…
Linearity = Linieritas  Y = bX + a
- hasil pengukuran menggunakan suatu
metode analisis yang berupa: abs, luas area,
atau tinggi puncak menunjukkan proporsio-
nalitas dengan kadar zat yang dianalisis

Syarat:

Koefisien korelasi [ r ] ≥ 0,999

Kazakevich and LoBrutto, 2007, p.471-481; Ahuja and Rasmussen, 2007, p.292;
Snyder dkk., 1997, p. 691 dan Chan dkk., 2004, p.16.
PERHIT. KDR 19
Rentang Linearitas [ ICH ]

Pada rentang tersebut:


Paling tidak digunakan 5 (lima) macam tingkatan
konsentrasi

PERHIT. KDR 20
Cara Menentukan Linearitas Kalibrasi
[ Replikasi 3 kali ] bolehkah repeatasi?

PERHIT. KDR 21
PERHIT. KDR 22
PERHIT. KDR 23
Kurva Baku [ 3 replikasi ]

Lakukan replikasi !

PERHIT. KDR 24
Apa perbedaan replikasi dan repeatasi??

TNK STD 25
Lakukan replikasi !
Haruskah Abs: 0,2 -
08? Kenapa?

PERHIT. KDR 26
TNK STD 27
Respon Sampel  Kadar ?
 Respon sampel hasil pengukuran dicatat

 Kemudian nilai tersebut dimasukkan ke


persamaan garis regresi yang merupakan:

Hubungan antara kadar standar


versus
respon standar

Kadar Sampel

TNK STD 28
Contoh
 Seorang peneliti melakukan pengukuran kadar amoxicillin
dalam suatu sampel tablet secara HPLC dengan metode
Standar External multiple point calibration. Luas Area
kromatogram dari sampel adalah 11345. hitung kadar
amoxicillin tsb?
pengukuran Standar baku amoxicillin adalah sbagai berikut.

Konsentrasi standar Luas Area


5 ppm 7685
10 ppm 14567
15 ppm 21987
20 ppm 29087
25 ppm 35879
TNK STD 29
Standar Internal

TNK STD 30
Standar Internal

-Senyawa yg digunakan berbeda dg senyawa yg


dianalisis dalam sampel

-Harus dapat terpisah sempurna pada proses


kromatografi

-Dapat mengkompensasi perubahan ukuran


sampel atau konsentrasi akibat variasi
instrumental

TNK STD 31
lanjutan…

PENGGUNAAN STANDAR INTERNAL


Utamanya

Untuk Sampel Yang Memerlukan

TAHAPAN PREPARASI

yang cukup signifikan panjang/rumit

TNK STD 32
lanjutan…

TAHAPA TERSEBUT MELIPUTI


Reaksi derivatisasi
Filtrasi
Ekstraksi

sebagian sampel hilang

TNK STD 33
lanjutan…

Bila ditambahkan pada sampel sebelum mulai


preparasi

dapat digunakan untuk


mengkoreksi
sampel yang hilang selama preparasi

TNK STD 34
Syarat
Standar Internal

TNK STD 35
Syarat Standar Internal

- Terpisah sempurna dari peak senyawa yg


dianalisis dan peak lain (HPLC)

- Memiliki waktu retensi mirip sampel

- Tidak terdapat dalam sampel awal

- Dapat me mimic analit disetiap tahap preparasi


sampel

TNK STD 36
lanjutan…

- Memiliki respon terhadap detektor serupa


dengan respon analit pada konsentrasi yg
digunakan

- Tidak harus memiliki kemiripan secara kimiawi


dengan analit

- Stabil dan tidak bereaksi dg sampel atau fase


gerak

- Tersedia komersial dg kemurnian tinggi


TNK STD 37
lanjutan…

Ditambahkan ke dalam larutan


seri kadar senyawa baku dan sampel
dengan konsentrasi tetap

(  kons. Sampel )

TNK STD 38
Calibration Methods
Internal Standards

1.) Known amount of a compound, different from analyte, added to the


unknown.
(i) Signal from unknown analyte is compared against signal from internal standard
 Relative signal intensity is proportional to concentration of unknown
- Valuable for samples/instruments where response varies between runs
- Calibration curves only accurate under conditions curve obtained
- relative response between unknown and standard are constant
 Widely used in chromatography
 Useful if sample is lost prior to analysis

Area under curve proportional


to concentration of unknown (x)
and standard (s)

Area of analyte signal  area of s tan dard signal 


 F  
Concentration of analyte  Concentrat ion of s tan dard 

Ax A 
 F S 
TNK STD
 X   S   39
TNK STD 40
Respon Sampel  Kadar ?
 Respon sampel juga dibuat rasio dengan
respon standar internal [ IS ].

 Kemudian nilai tersebut dimasukkan ke


persamaan garis regresi yang merupakan:

Hubungan antara kadar standar


versus
respon standar/respon IS

Kadar Sampel
TNK STD 41
Contoh
 Penetapan kadar hidrokortison dalam sebuah krim
dengan menggunakan baku internal betametason
dengan konsentrasi standar 5 ppm. Jika respon
sampel menunjukkan luas puncak hidrokortison
23564 dan luas puncak betametason 5693. maka
tentukan konsentrasi hidrokortison dalam sampel!

TNK STD 42
TNK STD 43
Standar Adisi

TNK STD 44
Standar Adisi
- Senyawa standar yg di + kan sama dengan
senyawa analit dalam matriks

- Standar dg berat yg berbeda ditambahkan ke


dalam sampel (matriks) yang jumlahnya sama

- Kemudian dilakukan pengukuran kadarnya

- Paling sering digunakan dalam trace analysis


( kons. analit < 0,1 % )
TNK STD 45
lanjutan…

SYARAT

Respon analit sebelum di spiking


harus menghasilkan
nilai

S / N > 10
TNK STD 46
Standard Addition
Methods
Calibration Methods
Standard Addition

1.) Protocol to Determine the Quantity of an Unknown


(i) Known quantities of an analyte are added to the unknown
- known and unknown are the same analyte
- increase in analytical signal is related to the total quantity of the analyte
- requires a linear response to analyte

(ii) Very useful for complex mixtures


- compensates for matrix effect  change in analytical signal caused by
anything else than the analyte of interest.

(iii) Procedure:

(a) place known volume of unknown sample in multiple flasks

TNK STD 48
Calibration Methods
Standard Addition

1.) Protocol to Determine the Quantity of an Unknown


(iii) Procedure:

(b) add different (increasing) volume of known standard to each unknown


sample

(c) fill each flask to a constant, known volume

TNK STD 49
Method of Standard Addition
adds varying amount of standard to an unknown
which already contains some analyte

1. Add same quantity


of unknown sample
to a series of flasks
2. Add varying
amounts of
standard (made in
solvent) to each
flask, ex.
0,5,10,15mL)
3. Fill each flask to
line, mix and
measure

TNK STD 50
Calibration Methods
Standard Addition

1.) Protocol to Determine the Quantity of an Unknown


(iii) Procedure:

(f) Plot signals as a function of the added known analyte concentration and
determine the best-fit line.

X-intercept (y=0) yields  X  f


which is used to calculate X i from:
 
X i  X  f  V
 Vo 

TNK STD 51
Calibration Methods
Standard Addition

1.) Protocol to Determine the Quantity of an Unknown


(iii) Example:
Tooth enamel consists mainly of the mineral calcium hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2. Trace
elements in teeth of archaeological specimens provide anthropologists with clues about
diet and disease of ancient people. Students at Hamline University measured strontium in
enamel from extracted wisdom teeth by atomic absorption spectroscopy. Solutions with a
constant total volume of 10.0 mL contained 0.750 mg of dissolved tooth enamel plus
variable concentrations of added Sr. Find the concentration of Sr.

Added Sr (ng/mL = ppb) Signal (arbitrary units)


0 28.0
2.50 34.3
5.00 42.8
7.50 51.5
10.00 58.6
TNK STD 52
Standard Addition

TNK STD 53
Terima Kasih

TNK STD 54