Kromatografi Cair (KC)

• Merupakan sistem kromatografi dengan fase

gerak cairan

Bagaimana fase diamnya?

Jawab :
Bisa padat bisa juga cair
Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi
Gas hanya 10%, mengapa ?

Karena Kromatografi Cair

1. Mempunyai banyak mekanisme pemisahan
2. Tidak ada persyaratan analit harus menguap,
sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik
didih relatif tinggi
3. Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan)
4. Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt
5. Tidak harus mahal: KLT, KKt
 Chromatographic Mechanisms
 The separation mechanism depends upon differences in
polarity between the different feed components. The more
polar a molecule, the more strongly it will be adsorbed by a
polar stationary phase. Similarly, the more non-polar a
molecule, the more strongly it will be adsorbed by non-
polar stationary phase.

 Chromatographic techniques are based on four different

sorption mechanisms :
 surface adsorption
 partition
 ion exchange
 size exclusion
Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi
jenis peralatan ?
Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti
berbeda dengan KCKT?

Jawab :
Jenis peralatan tidak mempengaruhi
mekanisme pemisahan secara
kromatografi Cair

Terkadang mekanisme pemisahan dalam KLT

sama dengan KCKT
 ADSORBSI

KCKT/HPLC
PARTISI

KLT PERTUKARAN
ION
Krom. Kertas Mekanisme PASANGAN ION

Krom. Kolom SIZE

EXCLUSION

Krom. Gas FILTRASI GEL

PERMEASI GEL
Mengapa begitu banyak mekanisme?
Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi
mempunyai bermacam mekanisme?

Jawab
Tidak, dalam satu kromatografi “hanya” terdapat satu
mekanisme saja
Misal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme
Adsorbsi
Misal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme
partisi
Faktor apa yang mendasari kita memilih satu
mekanisme pemisahan dalam kromatografi ?

Jawab :
Yang mendasari kita memilih satu mekanisme
pemisahan dalam kromatografi sifat dan jenis
analit yang ingin dipisahkan.
 Surface Adsorption Chromatography

 Adsorbsi : penyerapan pada permukaannya saja &

jangan sekali-kali dikacaukan dengan proses absorbsi yg
berarti penyerapan keseluruhan.
 Adsorbsi pada permukaan fase diam melibatkan
interaksi-interaksi elektrostatik spt ikatan hidrogen,
penarikan dipol-dipol, dan penarikan yg diinduksi oleh
dipol.
 Surface Adsorption Chromatography
During a surface adsorption
chromatography process, there is
competition for stationary phase
adsorption sites, between the
materials to be separated and the
mobile phase.

Feed molecules of low polarity

spend proportionally more time
in the mobile phase than those
molecules that are highly polar,
which are retained longer.
Therefore the components of a
mixture are eluted in order of
increasing polarity.
 The choice of stationary phase is governed by the
polarity of the feed components. If the feed components
are adsorbed too strongly, they may be difficult to
remove. Weakly polar mixtures should be separated on
highly active absorbents, or little or no separation will
occur.

 The choice of mobile phase is equally important. The

polarity of the mobile phase should be chosen to
compliment the choice of stationary phase. In general,
good separation is achieved by using fairly polar
stationary phases and low polarity mobile phases such as
hexane.
Silika gel adalah senyawa kimia yang tersusun dari silikon dan
oksigen yang membentuk globula- globula SiO44- tetrahedral
dalam suatu pola secara acak dan membentuk kerangka tiga
dimensi yang ukurannya lebih besar, dengan ukuran partikel
1,25µm (Osick, 1982 ).
Rumus kimia silika gel secara umum adalah SiO2.xH2O. Silika
gel mempunyai struktur yang berlubang, tidak berbentuk
(amorf) yang tersusun dari SiO2 dengan porositas tinggi sekitar
800 m2/g, yang berguna menyerap air setiap saat, yang
membuat silika gel berfungsi sebagai pengering (drying agent),
dan ketika jenuh dengan air silika gel dapat diregenerasi
(dikeringkan) dengan pemanasan sampai 1500C (300 0F).
Porositas silika gel akan mengalami peningkatan dengan
naiknya luas permukan pada silika gel.
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI ADSORBSI

Untuk analit yang bagaimana ?

Jawab: untuk analit yang polar

Bagaimana prinsipnya:
Adsorbsi dan desorbsi
Bagaimana maksudnya adsorbsi-desorbsi

Jawab :
Anda ingat “like dissolve like”, seperti
itulah mekanismenya.

Perjanjian :
dalam kromatografi adsorbsi: fase diam
selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll).
Berdasarkan perjanjian tersebut
Jika fase diam Polar, kemudian
Ada campuran analit, dengan
sifat Polar dan lainnya non
polar, maka yang bersifat polar
akan disukai oleh fase diam
(dengan kata lain teradsorbsi
lebih kuat) dibanding analit lain
yang kurang polar.

Analit Lebih
polar m = fase gerak
s = fase diam (polar)
 Cerita mekanisme adsorbsi

Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam,

selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit
tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih
polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga
polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding
analit yang kurang polar.

Sehingga => terjadi pemisahan

Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi
1. Digunakan untuk pemisahan analit yang bersifat
polar
2. Fase diam yang digunakan bersifat polar : misal
Silika dan Alumina
3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi
4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika pada
KLT atau pun KCKT dll, maka mekanismenya
adalah adsorbsi.
Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut
dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?

kuat
HO
SiOH

SiOH

lemah

OH
 Partition Chromatography

 Unique to chromatography is the

liquid-supported or liquid-bonded
solids, where the mechanism is
absorption into the liquid, also
referred to as a partition mode
of separation or partition
chromatography. With mobile
liquid phases, there is a tendency
for the stationary liquid phase to
be stripped or dissolved.
 Therefore, the stationary liquid
phase has to be chemically
bonded to the solid bonding
support.
 In partition chromatography, the stationary liquid
phase is coated onto a solid support such as silica gel,
cellulose powder, or kieselguhr (hydrated silica).

 Assuming that there is no adsorption by the solid

support, the feed components move through the system
at rates determined by their relative solubilities in the
stationary and mobile phases.
 KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI PARTISI

Partisi merupakan proses sorpsi yg analog

dengan ekstraksi pelarut.
Fase diam cair diikatkan pada padatan lapis
tipis yg inert. Karena fase diam cair diikatkan
pada padatan pendukung, maka masih
diperdebatkan apakah proses sorpsinya
merupakan partisi murni atau partisi yg
dimodifikasi (modified partition) karena
adsorpsi jg mungkin terjadi.
Dalam partisi yg sebenarnya (true
partition), solut akan terdistribusi diantara
fasa gerak & fase diam sesuai dengan
kelarutan relatif diantara keduanya.

Mekanisme partisi murni mungkin hanya

terjadi dalam kromatografi gas-cair.
 KROMATOGRAFI PARTISI

Untuk analit yang bagaimana?

Jawab: untuk analit yang Non-polar

Bagaimana prinsipnya :
partisi
 Apa yang dimaksud dengan partisi?

Jawab:
Ingatkah anda apa yang akan terjadi jika
analit dimasukkan dalam corong pisah yang
berisi dua cairan yang tidak saling larut ?
Analit tersebut setelah terjadi
kesetimbangan sebagian akan masuk ke
cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke
cairan dua.
Apakah bisa fase diam berupa cairan?
Jawab : bisa

Apakah tidak terjadi abrasi jika terkena

aliran fase gerak ?
Jawab : bisa

Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi ?

Jawab : cairan tersebut ditambatkan dalam
padatan
Bagaimana jika kita menginginkan cairan
C18H36 sebagai fase diam ?
Jawab : Cairan tersebut direaksikan secara
kimia dengan padatan silika.

-Si-C18H35

Si
 Perjanjian:
Kromatografi partisi: menggunakan fase
diam non polar, dan fase gerak polar

Sistem kromatografi dengan menggunakan

fase diam non polar, dan fase gerak polar
dikenal sebagai fase balik
 Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi
menjelaskan pemisahan kedua analit berikut ?

Jawab: A B
Ingat perjanjian : fase diam adalah bersifat non polar.
Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B
dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi
masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase
gerak. Senyawa B akan terpartisi lebih banyak dalam
fase diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan
tertahan lebih lama pada fase diam.
 Bagaimana interaksi ?

Interaksi
hidrofobik Solven polar

Non-polar
 Hidrofobisitas

 Jika sampel memiliki

– CH3CH2CH2--- : rantai karbon Hidrofobisitas
– : gugus aromatis
Jadi lebih kuat

 Jika sampel memiliki

– -COOH : gugus karboksil Hidrofobisitas
– -NH2 : gugus amino
jadi lebih lemah
– -OH : gugus hidroksil
– X
Waktu retensi dan Hidrofobisitas
OH

C18 (ODS)
lemah

kuat
OH
Pengaruh fase diam

C8

Medium
C18 (ODS)
sampel
kuat C4
sampel
lemah
sampel
Mekanisme pemisahan untuk
melekul ionik
 Ion Exchange Chromatography (IEC)

In this process, the stationary phase consists of an insoluble porous

resinous material containing fixed charge-carrying groups. Counter-ions
of opposite charge are loosely complexed with these groups.

Passage of a liquid mobile phase, containing ionised or partially ionised

molecules of the same charge as the counter-ions through the system,
results in the reversible exchange of these ions.
The degree of affinity between the stationary phase and feed ions dictates
the rate of migration and hence degree of separation between the different
solute species.
 PERTUKARAN ION
 Pertukaran ion merupakan proses dimana solut-solut ion
dalam fase gerak dapat bertukar dengan ion-ion yg bermuatan
sama yg terikat secara kimiawi pada fase diam.
 Fase diam dapat berupa padatan polimer yg permeabel spt
resin organik yg tidak larut atau silika yg dimodifikasi scr
kimiawi.
 Fase diam ini mengandung gugus-gugus dengan muatan yg
tetap & ion-ion lawannya yg mobil.

Pertukaran anion : X- + R+Y- Y- + R+X-

Pertukaran kation : X+ + R+Y- R+ + Y-X+
Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan
untuk analit ion ?

1. Kromatografi pasangan ion

2. Kromatografi pertukaran ion
 Kromatografi Pasangan Ion

Apa dasar pasangan ion?

Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi

beberapa mekanisme, jika hal tersebut terjadi
maka dapat mengakibatkan pemisahan tidak baik,
misalnya terjadi pengekoran dan atau puncak
pecah.
Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara
dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga
mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak
partisi dengan sedikit adsorbsi
Kromatografi Fase Terbalik
dengan pasangan ion
Ion-Pair Reagent
 Untuk apa dipasangkan ?

Jawab :
Agar molekul analit netral sehingga bersifat non
polar.
Ingat : PARTISI: Pemisahan senyawa non polar
dengan fase diam non polar (misal C-18)
 Mekanisme Pertukaran Ion

 Pemisahan pertukaran ion didasarkan pada perbedaan

kekuatan interaksi ion terlarut dengan resin (fase diam).
Jika ion terlarut berinteraksi scr lemah dengan resin.
karena adanya ion pada fase gerak, maka ion terlarut
akan keluar lebih dulu. Sebaliknya, jika ion terlarut
berinteraksi scr kuat dengan resin daripada ion pada
fase gerak, maka ion terlarut akan keluar belakangan.
 Mekanisme : Penukar ion
Jika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion

Kekuatan antar ion

R
N+ R Sampel
R
Jika analit kation maka fase diam anion, fase gerak kation

+ + + + +
+
- Sampel +
SO3 +
+ + + + +
 Mekanisme pemisahan
berdasarkan ukuran molekul
 Size Exclusion Chromatography (SEC)
In this process, also known as gel permeation chromatography,
molecules of a feed material are separated according to their size or
molecular weight. The stationary phase consists of a porous cross-
linked polymeric gel.
 Apakah SEC (kromatografi
Eksklusi) ?
 Eksklusi berbeda dari mekanisme sorpsi yg lain, yakni
dalam eksklusi tidak ada interaksi spesifik antara solut
dengan fase diam.
 Teknik ini unik karena didasarkan pada ukuran molekul
dari zat padat pengepak (fase diam).
 Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-
lubang sangat kecil (porous) yang inert.
 Fase gerak berupa cairan.
 Kromatografi jenis ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan
bentuk struktur dan ukuran molekul.
 Size Exclusion Chromatography
(SEC)
– GPC (Gel Permeation Chromatography)
• terutama untuk sampel polimer

– GFC (Gel Filtration Chromatography)

• terutama untuk sampel biologi
 Prinsip SEC

 Tidak ada kekuatan interaksi

 Perbedaan waktu tempuh
 SEC
 Fase diam: partikel berpori
 Molekul ber BM besar
 Molekul relatif besar tidak dapat dijebak
oleh fase diam, akibatnya waktu tambat
singkat
 Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase
diam, akibatnya waktu tambat lama
 Hubungan antara
Bobot molekul & waktu tambat
Batas eksklusi
Berat molekul (LogMW)

Batas permeasi
Kolom
GPC

Waktu