Resistance to environmental stresses by Vibrio

vulnificus in the
viable but nonculturable state

Oleh:
1.Sovia Indah N (14/365140/PN/13697)
2.Amir Mugozin (14/365096/PN/13672)
3.Isnin Dwi Saputri (14/369622/PN/13936)
4.Ardiana S (15/381098/PN/14193)
5.Renata Risky (14/367360/PN/13835)
6.Anisa Nada (14/365172/PN/13718)
 Vibrio vulnificus

Vibrio vulnificus => bakteri yang patogen di tiram pada tahun1976

Vibrio vulnificus => di daerah perairan hangat yang bergaram (halofilik)

Vibrio vulnificus umumnya hidup membentuk koloni di tiram, remis, plakton,

maupun kepiting yang hidup di perairan asin.

Orang yang beresiko tinggi mendapat sakit yang serius dan kematian pada infeksi
Vibrio vulnificus adalah yang memiliki gangguan hati, hemokromatosis (kelainan
zat besi tubuh), diabetes, gangguan ginjal, gangguan sistem imun (termasuk HIV),
dan penggunaan steroid jangka panjang untuk asma atau arthritis, dan kanker.
 Pendahuluan

Mikroorganisme harus bisa mendeteksi perubahan

lingkungan dengan tepat dan tanggap agar dapat bertahan
hidup (Sonenshein, 2000).
Siklus dye-off dan re-emergence sekarang diakui karena
sering masuk ke sel dalam keadaan dormansi yang sering
diketahui sebagai keadaan “Viable But NonCulturable”
(VBNC).
 Keadaan VBNC muncul sebagai strategi umum untuk
bertahan hidup diantara kedua bakteri Gram positif maupun
Gram negatif, termasuk V. vulnificus.
Konsumsi kerang mentah atau kurang matang dapat
menyebabkan septicaemia dasar dengan rata-rata korban
jiwa >50%.
 Seperti semua organisme estuari, patogenini harus
dapat bertahan hidup dan beradaptasi terhadap perubahan
lingkungan yang cepat.
Hanya sedikit studi yang telah memeriksa apakah sel-sel
V. vulnificus ketika keadaan VBNC lebih atau kurang tahan
terhadap perubahan lingkungan.
 Tujuan Penelitian

Menentukan apakah sel-sel dari patogen ketika keadaan

VBNC terlindung terhadap perbedaan stres lingkungan
dibandingkan dengan culturablenya.
 Pertumbuhan sel dan induksi fase VBNC

Strain tumbuh dalam diinokulasi pada 1:

semalam pada suhu Tumbuh menjadi 100 pengenceran
kamar dalam kaldu fase log awal sampai ½ persen
infus jantung (heart (OD610 0,15- menggunakan air
infusion ) yang 0,25) dalam laut buatan (sekitar
digetarkan (HI; kaldu HI 15 ppt) (ASW)
Bacto, Sparks, MD)

Kedua genotipe ditaksir dapat dikultur terekspose secara fisik

ketika sel ditentukan menjadi atau kimia / pada suhu
nonculturable (<10 CFU mL-1) dan di 5 ° C untuk
fase VBNC , maka akan terekspose menginduksi fase
untuk perlakuan sekunder. VBNC.
 Penentuan Culturability dan viabilitas

Sel (fase eksponensial dan fase

VBNC) di letakkan pada agar HI
dan diinkubasi semalam pada
suhu 37 ° C sebelumnya dan
sesudah terpapar stres
challenges untuk menentukan
kemampuan kultur.
Tes viabilitas sel nonculturrable =>
alat Live/Dead BacLight Bacterial
Viability assay digunakan sebelum
dan segera setelah terpapar
perlakuan

. Uji BacLight dengan SYTO 9 dan propidium iodide untuk menentukan

integritas membran sel yakni dengan membedakan antara (membran sel
hidup (utuh) => menghasilkan fluoresensi hijau, dan selaput sel yang rusak
=> menghasilkan sel fluoresensi merah).
Gambar 1: Alat Live/Dead BacLight Bacterial Viability assay
 Kondisi resuscitation/ kondisi menyadarkan

Sel V. vulnificus Kemampuan sel yang

Plating ke agar HI
diinkubasi nonculturable untuk
dengan inkubasi
semalam (sekitar menahan tekanan yang
sampai 48 jam
22 ° C; 1 mL kultur diterapkan ditentukan
pada suhu 37 ° C
VBNC). oleh resuscitation yang
berhasil.
 Perlakuan fisik dan kimia yang diaplikasikan pada
log-phase dan VBNC Sel

strain V. vulnificus C7184 /

k2 diberi tekanan yang
berbeda.Waktu terpapar
disesuaikan =>
pengurangan 99,9-99,99%
kelangsungan hidup sel-
sel tercapai
Pendekatan dengan kultur fase
logaritmik sebagai kontrol untuk
sel VBNC.
Persiapan VBNC (<10 CFU mL-
1) = kontrol + resuscitation
semalam (22 ° C) untuk
pemulihan dari fase
nonculturable membentuk
koloni pada agar HI.

1. Perlakuan panas (50 ° C)

2. Perlakuan oksidatif (H2O2 ; akhir 0,2 mM)
3. Perlakuan osmotik (paparan NaCl ;akhir 5 M)
4. Perlakuan pH (pH 3 atau 10; pH ½ ASW = +1 M HCl atau 1 M NaOH)
5. Perlakuan etanol (akhir 13%)
6. Perlakuan antibiotik dengan ampisilin (penghambat sintesis dinding sel; konsentrasi
akhir 100 Lg mL- 1) atau kloramfenikol (inhibitor sintesis protein; konsentrasi akhir 5 lg
mL- 1)
7. perlakuan logam berat (ZnSO4. 7H2O, akhir 3,4 mM atau CuSO4. 5H2O dengan
akhir 0,5 mM).

strain V. vulnificus
disentrifugasi pada 17.000
g, resuspended dalam 0,5
mL ½ kekuatan ASW + 1
mL RNA Protect (Qiagen ,
Valencia, CA) untuk
menstabilkan RNA
Ekstrak RNA (30 lL) diobati
selama 2 jam pada suhu 37 °
C dengan 6 U lL 1 dari
TURBO DNase. Tidak
adanya DNA dikonfirmasi
oleh PCR.
Ekstraksi RNA
Lisis bakteri => dengan
menggoyangkan sel yang dilindungi
RNA dengan 100 lL buffer TE s (10
. Ekstraksi RNA mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
total dilakukan yang mengandung lysozyme 1 mg
dengan kit RNeasy mL selama 30 menit (sel logaritmik)
Mini (Qiagen). atau 60 Min (sel dalam keadaan
VBNC) pada suhu kamar.
Pemurnian total RNA oleh pabrikan.
Penghapusan kontaminasi DNA dalam
ekstrak RNA=>dengan DNA TURBO
(Ambion Inc., Grand Island, NY).
Gambar 2: RNeasy Mini kit
Gambar 3. cara menggunakan
Rna kit
 Primer dan kondisi RT-PCR
RT-PCR semi kuantitatif
pada sel logaritmik dan
VBNC => untuk
membandingkan tingkat
transkrip dan menentukan
hubungan antara gen spoT,
relA, dan rpoS.
Produk amplifikasi
dipisahkan
Pada gel agarose 1% dan
divisualisasikan dengan
pewarnaan etidium bromida.
Transkripsi terbalik+amplifikasi PCR
dengan sistem RT-PCR ACCESS
RT-PCR amplifikasi berbeda (dari 20
sampai 24) =>untuk mendeteksi beda di
tingkat transkrip empat pasangan primer
(Tabel 1) dan mendeteksi ekspresi rpoS,
spoT, dan relA, serta tufA, sebuah gen
yang mengkodekan faktor pemanjangan
protein => untuk sintesis protein efisien, di
sini digunakan sebagai gen housekeeping.
 Analisis statistik

Dengan nilai rata-rata (eksperimen independen + kesalahan standar). Data

numerik ekspresi gen berdasarkan kerapatan rata-rata masing-masing band,
diikuti dengan menghitung rasio gen target terhadap nilai gen referensi.
Analisis statistik => one way ANOVA.
Hasil dan Pembahasan
 Ethanol Challenge

Sel eksponensial yang terpapar

etanol mengakibatkan hilangnya
kultur dalam waktu 60 menit.
Kultur VBNC mampu bertahan
pada perlakuan dan dapat dikuktur
kembali diikuti dengan resusitasi
selama semalam.
Sel-sel VBNC menjadi tidak aktif.
Modifikasi yang signifikan
diketahui terjadi pada membran dan
dinding sel VBNC, yang mungkin
terjadi dalam permeabilitas sel yang
menurun atau sensitivitas terhadap Gambar 4. Perubahan Etanol
bahaya molekul. Dalam 60 Menit
 Salinity Challenge

V. vulnificus mampu
mentoleransi berbagai macam
salinitas, namun salinitas >25
ppt memiliki efek yang buruk
terhadap kelangsungan hidup
organisme.

Gambar 5. Perubahan Salinitas

Tinggi Dalam 120 Menit
 Oxidative Challenge

Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa katalase
memainkan sebuah peran
penting dalam respon VBNC
pada banyak bakteri , termasuk
V. vulnificus.

Gambar 6. Perubahan Hidrogen

Peroksida Dalam 60 Menit
 pH Challenge

Gambar 7. perubahan asam (25 menit)

Antibiotic Challenge
 Heavy metal challenge (seng dan tembaga) => memainkan peran penting
sebagai kofaktor dalam reaksi biokimia

---Tembaga + radikal oksigen => produksi radikal hidroperoksida yang memiliki efek parah dan
merusak pada membran sel.
--- Seng pada tingkat tinggi + dengan tiol => menghambat reaksi penting di dalam sel

Hasil sensitivitas sel tumbuh dan VBNC ke ZnSO4 7H2O dan CuSO4 5H2O yang beracun bagi sel
logaritmik V. vulnificus (hilangnya kultur lengkap dalam beberapa menit setelah inkubasi, Gambar 2i
dan j ). Sel yang tidak dapat diobati mengalami tantangan Zn ++ selama 60 menit=> mampu melawan
kondisi mematikan dan mendapatkan kembali kultur yang signifikan setelah resusitasi (Gambar 2i).
Sebaliknya, sel + CuSO4 +> sensitif pada sel logaritmik dan VBNC (dari kedua genotipe) Gambar 2j.
Sel kultur V. vulnificus sensitif terhadap pengobatan antibiotik, inaktivasi termal, pH rendah, tinggi,
etanol, hidrogen peroksida, kadar garam tinggi dan logam berat.
Di kondisi bagian VBNC =>sel-sel dari kedua genotipe menunjukkan kemampuan yang sama untuk
menahan beberapa tekanan ini, mempertahankan kemampuan mereka untuk melakukan resusitasi
ke keadaan yang dapat dikultur sepenuhnya.
Sementara genotip E di kondisi VBNC => signifikan resistensi lebih besar terhadap pH rendah dan
tinggi, hidrogen peroksida, salinitas tinggi dan etanol dibandingkan dengan genotipe C.
 Expression of rpoS, relA and spoT genes in culturable and nonculturable
cells

Genotipe C V. vulnificus => tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ekspresi relA dan spoT antara sel VBNC
dan sel logaritmik, atau perbedaan yang signifikan dalam ekspresi rpoS. Namun, ekspresi relA berbeda secara
signifikan (P <0,0035) pada sel genotipe E di kondisi VBNC dibandingkan dengan sel logaritmik (Gambar 4b).
Pada E. coli, sel tidak makan setelah 30-32 hari pada suhu 4 ° C, sedangkan sel V. vulnificus
hanya memerlukan waktu 5-7 hari untuk memasuki kondisi VBNC => perbedaan waktu yang
diperlukan untuk sel mencapai nonkulturabilitas memainkan peran penting dalam waktu dan / atau
tingkat ekspresi gen.

Meskipun regulasi gen relA, pada kasus strain V. vulnificus JY1701, tampaknya tidak
meningkatkanTingkat ekspresi rpoS, mungkin ada beberapa peran dalam membiarkan sel E-
genotipe bertahan terhadap perubahan lingkungan yang lebih baik daripada sel C-genotipe. Hal ini
sesuai kesepakatan dengan Warner & Oliver (2008) yang melaporkan bahwa

E-genotipe V. vulnificus mendominasi pada tiram, sedangkan di perairan muara, kedua genotipe
ditemukan dalam jumlah yang hampir sama. Penelitian lebih lanjut untuk menjelaskan peran (p)
ppGpp dalam ekspresi rpoS serta kemampuan sel V. vulnificus dari kedua genotipe untuk
bertahan dalam lingkungan yang menantang diperlukan.

Singkatnya, sel kultur V. vulnificus sensitif => semua tekanan yang diperiksa. Sel-sel patogen
pada VBNC => punya ketahanan yang luar biasa terhadap suhu tinggi, pH rendah dan tinggi, stres
oksidatif dan osmotik, dan paparan etanol, seng, dan kloramfenikol dan ampisilin. Temuan ini
sangat penting bagi industri makanan, di mana tekanan semacam itu sering digunakan untuk
mengurangi populasi bakteri, dan untuk petugas kesehatan masyarakat.
 Sesi Tanya Jawab
1. Mas Wawan: Saat ekstraksi RNA terdapat perbedaan waktu. Mengapa log
sel waktunya 30 menit, sedangkan VBNC waktunya 60 menit?
Jawab: ketika fase VBNC terdapat perubahan morfologi dari fase log, salah
satunya yaitu dinding sel. Dinding sel menebal pada fase VBNC, maka dari
itu membutuhkan waktu lebih lama untuk ekstraksi.
2. Mas Tyar: Terkait pemberian logam berat, bisakah digunakan pada
pangan?
Jawab: perlakuan logam berat digunakan untuk menghilangkan atau
mencegah VBNC mengontaminasi produk, bisa diberikan pada peralatan
dan lingkungan tempat produksi.
3. Mas Faiz: a. Mengapa Zn pada VBNC dapat dikutur? b. Mengapa
penggunaan antibiotik hasilnya resisten?
Jawab: a. Karena dinding sel bakteri pada fase VBNC terlindungi dari
konsentrasi logam berat seperti Zn, sehingga sel tidak mengalami
kerusakan dan dapat dikultur. b. Karena terjadi perubahan morfologi yaitu
dinding sel menjadi lebih tebal, sehingga resisten terhadap antbiotik.