PENGEMBANGAN METODE

ANALISIS KUERSETIN
MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

Kelompok 7

Yulien Ratu Kania 260110140143

Jovian Ghamal de Vito 260110140145
Ghina Ramadhani 260110140146
Ahmad Fauzi 260110140147
Pendahuluan

 Kuersetin
- Golongan flavonol (bagian dari flavonoid)
- Banyak terkandung dalam buah-buahan dan sayuran
- Memiliki 5 gugus -OH bebas yang dapat disubstitusi oleh gugus asil
melalui reaksi esterifikasi.
Struktur Kuersetin

Struktur kuersetin
Kandungan kuersetin yang mudah
ditemui
 Teh Hijau (Camellia sinensis ; 2000–2500 mg/kg)
 Apel (44 mg/kg)
 Bawang merah (1910 mg/kg)
 Skema Pengembangan Analisis
Kuersetin
Woisky, 1998 Chang, 2002 Mamen, 2013

Sampel hanya Percobaan untuk Membuktikan

dilarutkan dengan menghitung kadar penelitian chang,
metanol kemudian flavonoid total dengan 2002 dengan melihat
direaksikan dengan 1 menggunakan metode pergeseran
ml AlCl3 5% AlCl3 dan 2,4- batokromik dari reaksi
Dinitrophenylhydrazine kuersetin dengan
alcl3 dan kalium
asetat
Prinsip

 Metodenya adalah bahwa aluminium klorida membentuk

kompleks asam stabil dengan gugus keto C-4 dan C-3 atau
C-5 gugus hidroksil flavon dan flavonol. Sebagai tambahan,
aluminium klorida membentuk kompleks asam labil dengan
gugus ortodihidroksil dalam cincin A atau B atau flavonoid

Struktur kuersetin
 METODE

Pembuatan larutan stock kuersetin

Penentuan Panjang gelombang maksimum

Validasi metode analisis

Uji stabilitas larutan standar pada suhu ruangan

Penentuan kadar kuarsetin

Pembuatan larutan stock kuersetin

10 mg kuersetin dilarutkan dalam etanol 80%, larutan disimpan pada freezer

sebelum digunakan

Penentuan Panjang gelmbag maksimum

Panjang gelombang maksimum ditentukan dengan mengukur absorbansi
maksimum dari larutan standar kuersetin 20 μg/ml pada daerah 250 nm- 500
nm. Larutan standar 20 μg/ml dipipet 0,5 ml di larutkan dengan 1,5 ml etanol
95% secara terpisah, ditambahkan 0,1 ml alumunium klorida, 0,1 ml natrium
asetat 1M, dan 2,8 ml akuades. Larutan kemudian diinkubasi selama 30 menit.

Penentuan kadar kuarsetin

0,5 ml sampel di larutkan dengan 1,5 ml etanol 95% secara terpisah, ditambahkan
0,1 ml alumunium klorida, 0,1 ml natrium asetat 1M, dan 2,8 ml akuades. Larutan
kemudian diinkubasi selama 30 menit. Aborbansi larutan diukur pada Panjang
gelombang hasil optimasi dengan Spektrofotometer UV-Vis
Validasi metode analisis

Lineaitas
Linearitas dibuat pada titik (50,60,70,80,90,100) μg/ml dengan 3 kali replikasi ditiap titik. Dibuat persamaan garis dan
dihitung koefisien korelasi

Akurasi dan presisi

Akurasi dan presisi dilakukan pada konsentrasi 80 % dengan 6 kali replikasi dan dihitung nilai RSD dan % PK

LOD dan LOQ

LOD & LOQ : Pengukuran batas deteksi dan batas kuantifikasi berdasarkan slope dan standar deviasi dari respons
LOD = 3,3 x SD/S
LOQ = 10 X SD/S

Spesisifitas
Dilakukan untuk melihat interferensi analit dari komponen eksipien dilakukan dengan cara mempreparasi sampel
sesuai dengan prosedur preparasi sampel yang telah disebutkan lalu di running, Setelah itu dapat dilihat hasil spektrum
dan dilihat inteferensi dari matrik ekstrak
 HASIL VALIDASI METODE ANALISIS
Linearitas
Linearitas ≥ 0,995 √ (USP, 2014
Konsentrasi
A1 A2 A3 Rata-rata Linearitas y = 0.0091x - 0.2046
Kuarsetin (ppm)
R² = 0.998
0.8
60 0.35 0.3496 0.3434 0.347666667
0.7
70 0.4266 0.4292 0.4282 0.428 0.6

80 0.5345 0.5288 0.5284 0.530566667 0.5

absorbansi
0.4
90 0.6095 0.6058 0.6136 0.609633333
0.3
100 0.7244 0.7031 0.7126 0.713366667
0.2

0.1

0
0 20 40 60 80 100 120
konsentrasi (ppm)
LOD dan LOQ

Konsentrasi
A1 A2 A3 Rata-rata yi (y-yi)2
(ppm)
60 0.35 0.3496 0.3434 0.347666667 0.3414 0.000039271

70 0.4266 0.4292 0.4282 0.428 0.4324 0.000019360

80 0.5345 0.5288 0.5284 0.530566667 0.5234 0.000051361

90 0.6095 0.6058 0.6136 0.609633333 0.6144 0.000022721

100 0.7244 0.7031 0.7126 0.713366667 0.7054 0.000063468

LOD dan LOQ

SB 0.000018722
LOD (ppm) 0.006789157
LOQ (ppm) 0.020573204
Presisi intra day dan Akurasi

Konsentrasi
% Perolehan RSD ≤ 2 %√ (USP, 2014)
Kuarsetin Absorbansi Kadar
Kembali
(ppm) Akurasi 98-102 %√ (USP, 2014)
0.5243 80.0989 100.1236
0.5325 81 101.2500
0.5128 78.83516 98.5440
80
0.5348 81.25275 101.5659
0.5288 80.59341 100.7418
0.5289 80.6044 100.7555
RSD (%) 1.4865 1.070798
 Stabilitas Penyimpanan Standar Kuarsetin Pada Suhu Ruang

S T A BIL IT A S PE N YIM PA N A N S T A N D A R KU E RS E T IN
D A L A M S U H U RU A N G
Konsentrasi
Konsentrasi 101.0000
Kuarsetin T (jam) Absorbansi Kadar (%)
(ppm)
(ppm) 100.5000

100.0000
0 0.5284 80.5495 100.6868

% Kadar
99.5000
1 0.5226 79.9121 99.8901
99.0000
2 0.5144 79.0110 98.7637
80 98.5000
3 0.51 78.5275 98.1593
98.0000
4 0.5087 78.3846 97.9808
97.5000
24 0.5132 78.8791 98.5989 0 5 10 15
Waktu (jam)
20 25 30
 Kadar kuersetin dalam ekstrak

No Absorbansi Kadar
1 0.3742 0.63604 % (63 mg/gr ekstrak)
2 0.4148 0.68066 % (68 mg/ gr ekstrak)
Simpulan

 Validasi metode analisis penetuaan kadar kuersetin dalam ekstrak

memenuhi persyaratan validasi
 Kadar kuarsetin dalam ekstrak etanol 70 % daaun jati belanda yaitu 65,5
mg/g ekstrak.
Metode Analisis Penetapan Kadar
Campuran PCT dan Kafein dalam
Tablet dengan KCKT
Pendahuluan

 Paracetamol khasiat Analgesik dan Antipiretik.

 Bentuknya = Tablet, Kapsul, Suspensi, Sirup, dll
 Pct banyak dikombinasikan dengan zat lain, yang paling umum
adalah Kafein.
 Kafein Alkaloid alam banyak ditemukan dalam minuman
 Kafein dapat dimanfaatkan dengan atau tanpa kombinasi, untuk
mengatasi migraine juga sebagai analgesik
 Karena PCT dan Kafein banyak dimanfaatkan dalam pengobatan,
determinasi dan QC dari kedua zat ini cukup penting dilakukan
 Teknik yang umum dimanfaatkan adalah dengan KCKT
 KCKT dipilih karena merupakan teknik pemisahan yang diterima
secara luas untuk analisis bahan obat ,baik dalam bulk atau dalam
sediaan farmasetik.
Metode
 Tahap Penelitian

Preparasi
Kondisi Preparasi Prosedur
Materials larutan
instrumen sampel Validasi
standar

 Parasetamol dan caffein RS

 Metanol HPLC grade (JT. Backer)
 Aquabidest (IPHA Laboratories)
 Tablet Panadol extra yang mengandung 500 mg PCT dan 65 mg
Kafein
 Tahap Penelitian

Preparasi
Kondisi Preparasi Prosedur
Materials larutan
instrumen sampel Validasi
standar

 KCKT (Dionex UltiMate 3000) dengan

detektor UV(Dionex UltiMate 3000)
Solvent degasser (Dionex UltiMate 3000)
 Fase diam : kolom SGE Analytical Enduro
Reverse Phase C-18,
 Fase gerak : air + methanol (60+40)
 Volume injection: 20 μL
 Laju alir : 0.75 mL/min
 Uv detector : 272 nm
 Tahap Penelitian

Preparasi
Kondisi Preparasi Prosedur
Materials larutan
instrumen sampel Validasi
standar

Melarutkan secara
akurat 50 mg PCT dan
Larutan stok PCT : 500 PPM
6,5 mg pada labu ukur
Larutan stok kafein : 65 ppm
100 ml dalam fase
gerak
 Tahap Penelitian

Preparasi
Kondisi Preparasi Prosedur
Materials larutan
instrumen sampel Validasi
standar

Timbang serbuk Dimasukan

10 tablet dibuat Ditambahkan
yang ekuivaln dalam labu ukur
serbuk 20 ml fase gerak
dengan 50 mg 25 ml
pct dan 6.5 mg
cafein

Di filter melalui Sebanyak 1 ml Volume larutan

0,45 μm nylon filter dan dipipet ke labu ditambahkan Disonikasi
diinjeksikan ke system ukur 10 ml dan hingga tanda selama 20 menit
KCKT dilarutkan dalam batas dengan
fase gerak fase gerak
 Prosedur Validasi
spesifisitas Dilakukan untuk melihat interferensi analit dari komponen eksipien
dilakukan dengan cara mempreparasi sampel sesuai dengan
prosedur preparasi sampel yang telah disebutkan lalu di running,
Setelah itu dapat dilihat hasil kromatogram dan dilihat inteferensi
dari matriks

Linearitas dibuat pada rentang 31,25 ppm – 250 ppm (parasetamol) dan
Linearitas dan range
4,06 ppm – 32,5 ppm (kafein) dan dilakukan tiga kali replikasi tiap konsentrasi
(PCT : KAF)
31,25 : 4,06 (pct 500 ppm diambil 0,625 ml kafein 65 ppm diambil 0,625 ml)
62,5 : 8,12 (pct 500 ppm diambil 1,25 ml kafein 65 ppm diambil 1,25 ml)
125 : 16,25 (pct 500 ppm diambil 2,5 ml kafein 65 ppm diambil 2,5 ml)
187,5 : 24,375 (pct 500 ppm diambil 3,75 ml kafein 65 ppm diambil 3,75 ml)
250 : 32,5 (pct 500 ppm diambil 5 ml kafein 65 ppm diambil 5 ml)
 Prosedur Validasi

Presisi dan Akurasi Dilakukan pada 3 level dan 3 kali replikasi dan dihitung %
Recovery dan RSD tiap rata-rata konsentrasinya

Konsentrasi PCT KAFEIN

50% 62.5 ppm 8.125 ppm
100% 125 ppm 16.25 ppm
150% 187.5 ppm 24.3 ppm

LOD dan LOQ LOD & LOQ : Pengukuran batas deteksi dan batas kuantifikasi
berdasarkan slope dan standar deviasi dari respons
LOD = 3,3 x SD/S
LOQ = 10 X SD/S
 Uji Stabilitas larutan standar
Stabilitas ditentukan dengan mengukur konsentrasi standar pada
waktu tertentu yang disimpan di suhu ruang pada jam ke 0, 1 dan 2.
Dengan konsentrasi standar pct: kafein awal (125,6:16,2 µg/ml)
 Hasil Validasi
Kurva Baku, Linearitas, LOD dan
LOQ Parasetamol Linearitas ≥ 0,995 √ (USP, 2014)

AUC PCT Kurva Baku PCT

KONSENTRASI RATA-RATA Yi (Y-Yi)^2
120
REP 1 REP 2 REP 3 y = 0.4125x + 0.695
100 R² = 0.9996
80

mAUC
31,25 12,275 13,788 12,279 12,78066667 13,679375 0,807676668 60
40
20
62,5 27,302 26,847 28,496 27,54833333 26,66375 0,782487674 0
0 50 100 150 200 250 300
125 50,189 54,716 50,753 51,886 52,6325 0,55726225
Konsentrasi (ppm)

187,5 76,786 78,704 79,734 78,408 78,60125 0,037345562 Persamaan garis y = 0,4125x + 0,696
R2 : 0,9996
250 104,389 102,969 103,375 103,5776667 104,57 0,984725444 SB : 0,366437464
Rata-rata : 55,22937
LOD (ppm) : 0,021894936
LOQ (ppm) :0,066348291
 Hasil Validasi
Kurva Baku, Linearitas, LOD Linearitas ≥ 0,995 √ (USP, 2014)
dan LOQ Kafein,
Kurva Baku Kafein
AUC KAFEIN Series1 Linear (Series1)
RATA-
Konsentrasi Yi (Y-Yi)^2
RATA 30 y = 0.8007x - 0.8708
25 R² = 0.9974
REP 1 REP 2 REP 3 20

mAUC
15
10
4,06 2,632 2,926 2,645 2,73433333 2,380042 0,125522349 5
0
0 10 20 30 40
8,12 5,815 5,766 5,724 5,76833333 5,630884 0,018892319 Konsentrasi (ppm)

16,25 10,833 11,855 11,684 11,4573333 12,140575 0,466819175 Persamaan garis y = 0,8007x – 0,8708
R2 : 0,9974

24,375 17,432 18,722 18,934 18,3626667 18,6462625 0,080426597 SB : 0,175585

Rata-rata : 12,78994
LOD (ppm) : 0,045304
32,5 25,653 25,625 25,61 25,6293333 25,15195 0,227894847
LOQ (ppm) : 0,137284
 Hasil Validasi
Akurasi
Akurasi 98-102 %√ (USP, 2014)
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 − 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
X 100%
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟

AUC Cstd+spike % Perolehan Kembali Rata rata PK

Standar Cspike
50% 100% 150% 50% 100% 150% 50% 100% 150%
89.169 110.084 139.549 214.4824242 265.1855 336.6158 104.1687 92.64679 99.86069
PCT 89.242 115.345 147.033 149.3770 214.6593939 277.9394 354.7588 104.4519 102.8499 109.537 100.4797
88.377 109.168 138.756 212.5624242 262.9648 334.6933 101.0967 90.8703 98.83539
Rata-rata 103.2391 95.45568 102.7444
19.876 25.567 32.929 25.91082803 33.01836 42.21281 101.0969 94.25599 100.5582
KAFEIN 19.714 26.487 35.305 17.7018 25.70850506 34.16735 45.18022 98.60522 101.3267 112.7321
99.3111
19.537 24.987 32.731 25.48744848 32.29399 41.96553 95.88285 89.79835 99.54367
Rata-rata 98.52832 95.12702 104.278
 Hasil Validasi PARASETAMOL RSD ≤ 2 %√ (USP, 2014)
AUC Waktu Retensi Kadar
50% 100% 150% 50% 100% 150% 50% 100% 150%
Presisi 89,17 110,08 139,55 3,39 3,39 3,39 104,17 92,65 99,86
Intraday 89,24 115,35 147,03 3,39 3,39 3,39 104,45 102,85 109,54
88,38 109,17 138,76 3,39 3,39 3,39 101,10 90,87 98,84
rata -
rata 88,93 111,53 141,78 3,39 3,39 3,39 103,24 95,46 102,74
SD 0,48 3,33 4,57 0,00 0,00 0,00 1,86 6,46 5,90
%RSD 0,54 2,99 3,22 0,00 0,00 0,00 1,80 6,77 5,75

KAFEIN
PARASETAMOL
AUC Waktu Retensi Kadar %RSD berdasarkan AUC
50% = 0,54%
50% 100% 150% 50% 100% 150% 50% 100% 150% 100% = 2,99%
19,88 25,57 32,93 4,93 4,93 4,92 101,10 94,26 100,56 150% = 3,22%
%RSD berdasarkan waktu retensi
19,71 26,49 35,31 4,93 4,93 4,92 98,61 101,33 112,73 50% = 0%
19,54 24,99 32,73 4,93 4,93 4,92 95,88 89,80 99,54 100% = 0%
rata - 150% = 0%
%RSD berdasarkan waktu retensi
rata 19,71 25,68 33,66 4,93 4,93 4,92 98,53 95,13 104,28 50% = 1,8%
SD 0,17 0,76 1,43 0,00 0,00 0,00 2,61 5,81 7,34 100% = 6,77%
%RSD 0,86 2,95 4,26 0,00 0,00 0,00 2,65 6,11 7,04 150% = 5,75%
 AUC Konsentrasi Kadar %
JAM

Stabilitas PCT KAFEIN PCT KAFEIN pct kafein

dan 0 54,323 9,214 130,0073 12,59497939 104,0058182 77,5075655

Kadar 1 54,225 9,27 129,7697 12,6649182 103,8157576 77,93795813

2 54,559 9,2866 130,5794 12,68565006 104,4635152 78,06553881

AUC KADAR %
Sampel
PCT KAFEIN PCT KAFEIN
1 95,684 22,126 115,208 110,5518652
2 102,188 23,623 123,0964 117,7483509
3 99,006 22,784 119,2371 113,7150499
Simpulan

 Validasi metode analisis parasetamol dan kafein dalam tablet

dengan HPLC dengan Fase gerak methanol + air (40+60), laju alir
0.75 ml/min dan volume injeksi 20 μL memenuhi persyaratan
validaasi
 Kadar parasetamo dalam tablet yaitu 119.1805 % dan kafein dalam
tablet yaitu 114.0050887 %
Lampiran
Kromatogram standar
Kafein
Lampiran
Kromatogram standar
Parasetamol
Lampiran
Kromatogram spike (100%)
Lampiran
Kromatogram sampel
Daftar Pustaka

 Chang, Chia-Chi, Yang, Ming-Hua, Wen, Hwei-Mei, & Chern, Jiing-

Chuan (2002). Estimation of total flavonoid content in propolis by
two complementarycolorimetric methods. Journal of Food and
Drug Analysis, 10(3), 178–182.
 Mamen, Deni & Mamen Daniel. (2012). A critical evaluation on the
reliability of two aluminum chloride chelation methods for
quantification of flavonoids. Food Chemistry 135, 1365–1368
 Woisky, R., & Salatino, A. (1998). Analysis of propolis: Some
parameters and procedures for chemical quality control. Journal of
Apicultural Research, 37,99–105.