Anda di halaman 1dari 22

KELOMPOK 7

WESTERN BLOT

Mata Kuliah Bioteknologi


Farmasi 2016
Nama Anggota :
Fitri Valentina S 142210101003
Nadya Dini Lestari 142210101045
Poppy Dwi NDJ 142210101047
Dwi Ayu Yuniarsih 142210101083
Indah Setyowati 142210101089
Dila Audilia R 142210101107
Yulintan Maulidar 142210101109
R.A Yashinta Nirmala S 142210101113
Definisi

Interpretasi Tujuan

Data Prinsip

Metode
Definisi
Western Blot adalah sebuah metode untuk
mendeteksi protein pada sampel jaringan
dengan imunoblotting. Imunoblot menggunakan
elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli
atau perubahan oleh jarak polipeptida atau oleh
struktur 3D protein.
Tujuan
1. Mengetahui keberadaan dan berat molekul
protein sampel dalam suatu campuran
2. Membandingkan reaksi silang antar protein
3. Mempelajari modifikasi protein selama sintesis
Dengan cara ini protein dalam hitungan
nanogram dapat terdeteksi
Prinsip
Prinsip teknik western blotting yaitu
mendeteksi protein spesifik pada sampel
jaringan yang homogen ataupun dari suatu
ekstraksi berdasarkan kemampuan protein
tersebut berikatan dengan antibodi.
Prinsip yang digunakan dalam western blot
adalah prinsip ikatan antigen-atibodi komplek.
Protein pada NC kita anggap sebagai antigen.
Antibodi primer adalah antibodi yang dapat
berikatan secara spesifik pada antigen pada
nitroselulosa atau PVDF(Polyvynilidine fluoride).
Agar dapat melihat ikatan dari antigen-antibodi
komplek maka kita memberikan warna pada
antigen-antibodi tersebut.
Tahapan Western Blot
Elektroforesis
Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam suatu tegangan listrik tertentu.
Dalam elektroforesis, biasanya sampel yang mengandung protein biasanya dicampur dengan SDS. SDS merupakan
suatu detergen yang memiliki muatan negatif.

Elektotransfer
Elektrotransfer adalah pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer. Tahap pemindahan tersebut
menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong transfer protein. Elektrotransfer dapat dilakukan dengan dua
metode, yaitu blotting semikering dan blotting basah.

Deteksi
Deteksi protein memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang bersifat spesifik.Variasi metode-metode
tersebut terutama terletak pada penggunaan antibodi primer dan sekunder, serta penggunaan molekul penanda.
Berdasarkan hal tersebut, ada dua metode deteksi, yaitu: metode langsung dan metode tidak langsung.
Metode Elektrotransfer

Blotting Semikering Blotting Basah


Blotting semikering menggunakan Blotting basah tidak menggunakan
kertas saring yang telah dibasahi kertas saring diantara gel poliakrilamid
dengan buffer transfer. Kertas saring dan gel transfer, tetapi kedua gel
tersebut diletakkan di antara gel tersebut diimpitkan dan direndam
poliakrilamid dan gel transfer. Transfer dalam buffer transfer. Susunan lapisan-
seperti ini dapat dilakukan selama 10- lapisan pada blotting basah
30 menit dengan arus lstrik tertentu. diperlihatkan pada Gambar 3 (Wenk
dan Fernandis, 2007). Transfer dengan
blotting basah dapat dilakukan 45
menit hingga 1 malam. Metode
blotting basah lebih umum digunakan
karena fleksibilitas metode tersebut
yang lebih baik.
Gel transfer yang umum digunakan pada WB ada dua, yaitu
nitroselulosa dan nilon. Pada sebagian besar aplikasi, nitroselulosa
lebih umum digunakan karena relatif tidak mahal dan bloking mudah
dan cepat dilakukan. Nilon juga digunakan terutama pada beberapa
keadaan khusus. Pertama, kapasitas pengikatan dengan protein yang
dibutuhkan jauh lebih besar dari kapasitas pengikatan nitroselulosa
dan protein. Kedua, protein terikat sangat lemah pada nitroselulosa.
Ketiga, adanya kebutuhan resistensi terhadap tekanan mekanik
(Bollag et al., 1996).
Langkah-langkah dalam Western Blot

• Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah


itu limfosit T atau fibroblas ataupun sel darah
1 tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin.

• Menyiapkan buffer agar pH dapat berada


2 pada jangkauan yang stabil.

• Menyiapkan antibodi yang akan digunakan


3 sebagai pelacak
Monoklonal antibodi maupun
poliklonal antibodi dapat
digunakan

Antibodi monoklonal adalah yang


lebih baik digunakan, karena :
1. Sinyal yang lebih baik Antibodi Poliklonal
2. Spesifisitas yang lebih tinggi 1.Mengenali lebih banyak epitop
3. Hasil yang lebih jernih pada
proses pembuatan film western blot
Contoh Hasil Uji dengan Western Blot
Intepretasi data
Intepretasi hasil dari western blot mirip
dengan SDS-PAGE elektroforesis.
Digunakan persamaan regresi linier dari
marker yang digunakan sebagai standart.
Pita sampel yang berwarna pada NC
merupakan protein dengan berat molekul
tertentu yang dihitung dengan menggunakan
persamaan regresi linier.
Persamaan regresi linier pada data ini didapatkan y =
0,593x + 1,365 dan R2 = 0,905.
Makin mendekati 1 maka akan makin baik hasil
intepretasinya. Pita yang berwarna pada NC adalah pita
protein dari shigella pili dan OMP shigella. Hal ini berarti
protein yang dapat berikatan spesifik dengan antibodi
primer (shigella antibodi 49 kDa) ada pada pili dan OMP
dari shigella. Banyaknya ikatan antigen-antibodi pada NC
menunjukkan bahwa banyak protein yang croslink dengan
antibodi tersebut. Kita hanya dapat mengetahui berat
molekul berapa saja dari protein antigen yang dapat
berikatan dengan antibodi, untuk dapat melihat seberapa
banyak ikatan yang terjadi kita dapat melakukan dengan
menggunakan Dot blot (semi kuantitatif) atau ELISA
(kuantitatif).
TERIMAKASIH