HEWAN TRANSGENIK & MATA KULIAH

BIOTEKNOLOGI
KLONING HEWAN 2016
 HEWAN TRANSGENIK

 Hewan transgenik : hewan model yg telah

dimodifikasi susunan gennya (menyisipkan gen
tertentu) secara rekayasa genetika dan diturunkan
pd turunannya
 Gen yang dimasukkan bisa merupakan gen yang
memang terdapat didalam organisme tersebut
(endogen) dengan tujuan untuk mendapatkan
ekspresi yang lebih kuat (overekspresi gen) dan bisa
pula gen atau fragmen DNA yang tidak terdapat
pada organisme tersebut (eksogen)
 HEWAN TRANSGENIK

 Tujuan penggunaan hewan transgenik :

1. Mempelajari regulasi gen-gen yang terkait dengan
perkembangan tubuh
2. Mempelajari fenotipe atau ekspresi dari gen
tertentu

 Contoh hewan transgenik :

1. Tikus transgenik
2. Zebra fish
 PERAKITAN HEWAN TRANSGENIK

 Tahapan persiapan hewan transgenik :

1. persiapan gen (transgen) – metode DNA cloning -
yang akan dimasukkan ke dalam pronukleus telur
tikus yang telah dibuahi (zigot)
2. persiapan tikus yang akan digunakan
3. persiapan alat dan bahan
4. persiapan sistem deteksi keberadaan transgen
dalam susunan genom ”calon” tikus transgenik
(tikus yang berkembang dari zigot yang disuntikkan
transgen).
 PERAKITAN HEWAN TRANSGENIK

 Persiapan transgen (DNA cloning)

 Fragmen DNA (gen) yang akan dimasukkan ke dalam
pronukleus zigot harus mengandung promoter, complete
protein coding region, sedikitnya satu intron dan ekor poli- A
 Transgen diamplifikasi menggunakan Polymerase Chain
Reaction (PCR).
 Produk PCR kemudian ditanam pada daerah kloning ( cloning
site) vector plasmid dengan menggunakan ensim ligase.
 REVIEW SINGKAT : PCR

 Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR)

merupakan metode enzimatis untuk melipatgandakan sekuen
nukleotida tertentu dari DNA.
 Empat komponen dasar PCR adalah :
(1) DNA cetakan (DNA template), yakni fragmen DNA yang akan
dilipatgandakan,
(2) primer, suatu oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang
mengawali sintesis DNA,
(3) deoksiribonukleotida (dNTP) terdiri atas dATP, dGTP, dCTP, dTTP
(4) enzim DNA polymerase : Taq DNA polymerase diisolasi dari bakteri
Thermus aquaticus, Enzim ini mempunyai kemampuan polimerisasi
tinggi dan tahan pada suhu tinggi.
 PERAKITAN HEWAN TRANSGENIK

 Vector yang mengandung transgen ini kemudian

ditransfeksikan kedalam bakteri tertentu dengan teknik heat
shock.
 Bakteri dikulturkan pada media agar (agar plate). Setelah
tumbuh, bakteri kemudian diperbanyak (dibiakkan) pada
media agar yang cair.
 Plasmid yang mengandung transgen kemudian diisolasi dari
bakteri yang telah dilisiskan. Fragmen transgen ini kemudian
diisolasi dari plasmid dengan menggunakan enzim restriksi
(restriction enzyme) dikuti dengan pemisahan dan pemurnian
pada gel agarosa dan electroforesis.
 Utk mengenali produk transgen dg protein endogen dapat
dilakukan dgn fusi dari sebuah epitope/peptida yang pendek
dengan protein dari transgen
 REVIEW SINGKAT : ELEKTROFORESIS

 Elektroforesis merupakan metode pemisahan dan analisis kualitatif

untuk makromolekul bermuatan seper ti protein dan DNA .
 Prinsip dasar dari elektroforesis adalah perbedaan muatan dan
ukuran molekul yang akan dipisahkan. Molekul tersebut bergerak
karena perbedaan muatan menuju kutub yang berlawanan, melalui
pori dari medium tetap.
 Grup fosfat pada DNA memberikan DNA bersifat alkali dan
bermuatan negatif sehingga apabila dialiri listik maka pita DNA
akan bergerak menuju anoda yang bermuatan positif. Molekul DNA
yang kecil akan bergerak lebih cepat tergantung dari ukuran pori
agarosa
 PERAKITAN HEWAN TRANSGENIK

Persiapan tikus transgenik

 Kelompok tikus betina superovulasi (superovulated female mice):
tikus betina dibuat menjadi superovulasi (banyak telur). Tikus
betina dewasa disuntik dengan Pregnant Mare’s Serum
Gonadotrophin (PMSG = efek FSH) dan disuntik HCG untuk
menstimulasi ovulasi. Tikus ini dikawinkan dengan tikus jantan
kelompok fertile male mice dan diperiksa ada tidaknya plug
kopulasi (copulation plug) besok paginya.
 Kelompok tikus jantan pengawin (fertile male mice): Tikus ini
dipakai untuk mengawini tikus betina untuk mendapatkan zigot.
Tikus yang dipakai berumur 6 -8 minggu dan mempunyai
penampilan reproduksi yang baik.
 .
Persiapan tikus transgenik

 Kelompok tikus betina yang dibuat hamil palsu

(pseudopregnant female mice ) : tikus betina yang akan
menerima zigot yang telah diinsersikan transgen kedalam
pronukleusnya. Tikus ini dikawinkan dengan tikus dari
kelompok tikus jantan steril dan dicek ada tidaknya plug
kopulasi (copulation plug) besok paginya. Tikus yang dipakai
berumur 6-8 minggu dengan berat badan antara 25 -35 gram.

 Kelompok tikus jantan steril (sterile male mice) : kelompok

tikus jantan yang telah disterilkan dengan cara vasektomi
Tikus ini akan dikawinkan dengan tikus betina
pseudopregnant female mice. Tikus yang dipakai berumur
sediktinya 2 bulan. Sebelum dipakai sebaiknya tikus ini dicek
ke ”steril” annya
 INSERSI GEN BARU KE DALAM ZIGOT

 Penyuntikan hormone PMSG intraperitoneal pada tikus

superovulated female mice, dilanjutkan dengan penyuntikan
hormon HCG 48 jam kemudian. Setelah disuntik HCG
superovulated female mice dikawinkan dengan tikus jantan
fertil
 Tikus diperiksa ada tidaknya plug kopulasi keesokan harinya.
Pada saat yang bersamaan tikus pseudopre gnant mice
dikawinkan dengan sterile stud male mice dan diperiksa ada
tidaknya pulg kopulasi keesokan harinya. Tikus dengan plug
positif dipisahkan dari tikus dengan plug negatif.
 Superovulated female mice dengan plug positif dimatikan
dengan cara cervical dislocation. Setelah disemprot dengan
alkohol 70% rongga perut dibuka, saluran telur (oviduct)
diangkat dan diletakkan dalam medium kultur.
 Tikus betina Insersi gen
superovulasi & Zigot diisolasi dr baru/transgen
dikawinkan dg tikus superovulasi kpd tikus betina
jantan fertil hamil palsu

Tikus betina
Deteksi transgen hamil palsu
dr anakan tikus dikawinkan dg
jantan steril
 INSERSI GEN BARU KE DALAM ZIGOT

 Zigot diisolasi dari oviduct dengan cara merobek

saluran telur ter sebut di bawah mikroskop. Saluran
telur yang banyak mengandung zigot akan tampak
menggelembung. Zigot diletakkan dalam medium
kultur yang mengandung ensim hyaluronidase
selama beberapa menit (1 -2 menit).
 Ensim hyaluronidase ini ber fungsi untuk
menghilangkan sel -sel kumulus yang menempel
pada permukaan zigot.
 Kemudian zigot dikumpulkan dalam petri dish yang
mgd media kultur, inkubasi suhu 37C, kelembaban
95% dan 5% CO2.
 INSERSI GEN BARU KE DALAM ZIGOT

 Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang

dibuahi (zigot) dengan alat : micromanipulator
 Sebelum dilakukan penyuntikan transgen kedalam zigot,
holding pipette diisi terlebih dahulu dengan mineral oil dan
dipasang pada tempatnya pada micromanipulator. Injection
pipette diisi dengan larutan yang mengandung transgen
dengan menggunakan daya isap kapiler. Injection pipette
dipasang pada tempatnya pada micromanipulator
 INSERSI GEN BARU KE DALAM ZIGOT

 Zigot tanpa pronukleus atau

pronukelus lebih dari 2 adalah
tidak normal dan tidak dapat
digunakan. Zigot di ”pegang” oleh
holding pipette. Setelah injection
pipette ditusukan ke dalam
pronukleus zigot, transgen
kemudian dipompakan ke dalam
pronukleus
 Organ reproduksi pseudopregnant female mouse dikeluarkan
dari tubuh dengan membuat sayatan pada daerah punggung.
 Zigot yang telah disuntik dengan transgen ditransfer kedalam
infundibulum pseudopregnant mice dengan menggunakan
mouth controlled pipette.
 Zigot yang telah ditransfer akan tumbuh dan berkembang
selama 21 hari.
 Anak tikus kemudian ditunggu hingga besar dan berumur 3
minggu. Dilakukan pemeriksaan ada tidaknya transgen yang
terintegrasi di dalam genom anak tikus tersebut dengan
menggunakan metoda Southern blot.
TIKUS TRANSGENIK
 PENGGUNAAN TIKUS TRASNGENIK

 Mempelajari gen-gen yang mengkode produksi hormon, Cth.

gen yang mengkode hormon pertumbuhan (GH) yg
menyebabkan pertumbuhan dramatis
 Mempelajari gen-gen regulasi perkembangan, misalnya
overekspresi gen homeobox, Hox 1 .4 pada tikus transgenik
menyebabkan perkembangan usus yang tidak normal
(Wolgemuth, 1989).
 Mempelajari gen-gen yang berperan dalam sistem imunologi,
misalnya ekspresi gene kappa pada tikus transgenik terbatas
hanya pada limfosit B (Storb et.al 1984)
 Mempelajari fungsi gen-gen virus yang menginfeksi jaringan
tubuh, misalnya hewan model untuk penyakit hepatitis B kronik
yang pembawa antigen permukaan virus hepatitis B (Chisari,
1985), aktivasi sel limfosit T pada tikus transgenik yang
mengkespresikan gen HIV -1 nef (Skowronski, 1993).
 ZEBRA FISH

 Alasan sbg hewan model transgenik :

 Mempunyai embrio transparant
 Waktu generasi singkat 2-3 bulan
 Penelitian : ekspresi GFP green flourescent protein pada
sistem saraf pusat
KLONING HEWAN
 Hewan Kloning : hewan yg terbentuk tanpa proses fertilisasi antara gamet
jantan dan betina, tp melalui transfer ini sel somatik ke dalam ovum

Mencit transgenik yang mengandung gen pembawa

hormon pertumbuhan tikus.
 Pembuatan hewan kloning diawali dengan menggantikan materi genetik pada
inti ovum yang haploid dengan materi genetik inti sel somatik yang diploid dari
hewan sejenis. Sel telur tsb setelah dicangkokkan dalam uterus akan mampu
berkembang menjadi individu yang identik dengan individu yang inti selnya
telah dipindahkan.
SEJARAH TRANSFER INTI SEL SOMATIK
(KLONING)

1952 – Briggs and King

mengklon berudu katak
1996 – Mammalia pertama yang
diklon dari sel domba dewasa 
Dolly, the sheep.
• 1998 – klon mencit
• 1998 – klon sapi
• 2000 – klon babi
SEJARAH KLONING “CC” Carbon Copy

• 2001 – klon kucing

• 2002 – klon kelinci
• 2003 – klon hasil persilangan
kuda dan keledai (mule)
• 2004 – klon kerbau
• 2005 – klon anjing
Proses pembuatan kloning domba
Domba hasil kloning
Dolly’s Life; From Aug. 1996 To Feb. 2003

No problems
after birth
Aug, 1996
Reported in
Get stuffed:
Nature, 1997
Dolly will stay in Overweight
the public eye. problem, 1998
Telomere length
Feb 14th, 2003
shorten, 1999
Lung cancer,
Arthritis, 2002
Euthanasia, 2003
AWAL KESUKSESAN – KLONING MANUSIA

 2001 – Pertama klon embrio manusia (hanya pada

tahap 6 sel) dibuat oleh Advanced Cell Technology
(USA)
 2004* – Pengakuan klon manusia pertama
menghasilkan blastosis dan menumbuhkan kultur
cell line (Korea) – selanjutnya dinyatakan bahwa
ada manipulasi

*Hwang, W.S., et al. 2004. Evidence of a Pluripotent Human

Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst.
Science 303: 1669-1674.
APLIKASI TRANSFER INTI SEL SOMATIK
kloning organisme yang mempunyai
keunggulan genetik

Menghasilkan hewan yang tahan penyakit

Mempertahankan spesies langka

Cangkok organ

Kloning terapi