Pengaruh Ekstrak Air Daun Sirsak

Terhadap Ekspresi Gen Caspase 3 Pada

Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa

Pembimbing :
Agli Adhitya Anugrah Putra 1. Prof. Dr. H. Herri. S.
Sastramihardja, dr., SpFK(K)
10100108060
2. Lelly Yuniarti, S.Si., M.Kes
Latar Belakang

Kejadian kanker serviks uteri

Di Indonesia kanker dengan jumlah kasus terbanyak kedua

setelah kanker payudara

Faktor Eksternal Faktor Internal

HPV 16 dan18 Siklus Sel

Suppressor gene dan Apoptosis

Caspase 3
 Pengobatan Kanker saat ini

Radiasi, Kemoterapi, operasi dan kombinasi

Memiliki efek samping

Terapi kemoterapi dari bahan alam yang efektif dan

toksisitasnya rendah MDR

Sirsak Anti Kanker

Caspase 3 ?
Identifikasi Masalah

1. Apakah ekstrak air daun sirsak dapat

meningkatkan ekspresi gen caspase 3 pada kultur
sel HeLa?
2. Berapa konsentrasi ekstrak air daun sirsak yang
dapat meningkatkan ekspresi gen caspase 3
paling bermakna pada kultur sel HeLa?
3. Apakah terdapat korelasi positif antara konsentrasi
ekstrak air daun sirsak dengan peningkatan
ekspresi gen caspase 3?
Tujuan dan Manfaat
Tujuan
• Umum:
Ekspresi caspase 3 yang
diberi ekstrak air daun sirsak
 Khusus:
 Konsentrasi ekstrak air
daun sirsak yang
meningkatkan caspase 3
paling bermakna
 Korelasi positif antara
ekstrak daun sirsak dengan
ekspresi caspase 3
Manfaat
• Manfaat akademik:
Informasi ilmiah pengaruh
ekstrak air daun sirsak terhadap
peningkatan ekspresi caspase 3
melalui mekanisme molekular
 Manfaat praktis:
Informasi awal kepada
masyarakat khususnya ahli
kesehatan pengobatan
kemoterapi dari daun sirsak
pada kanker serviks uteri yang
aman, efek samping rendah dan
murah.
Tinjauan Pustaka

• Epidemiologi Kanker serviks Uteri

• Pathogenesis Molekular Kanker Serviks Uteri
• Siklus Sel
• Caspase 3
• Sirsak
• Annonaceous Acetogenin
• Tanin
• Flavonoids
• Saponin
• Apoptosis
Kanker serviks uteri
• Epidemiologi
• Faktor Resiko
• Etiologi
Pathogenesis Kanker Serviks Uteri
Siklus Sel

Fase-fase siklus sel Ikatan cyclin dengan CDK

Apoptosis
Caspase 3

• Terletak pada kromosom 4q35.1

• Rantai tunggal zymogen tidak aktif dengan
rantai N-terminal prodormain
• Aktivasinya dengan proteolitik
• Caspase 3 merupakan caspase eksekusi
• Diaktifkan oleh caspase 3, caspase 8,
caspase activating protease, granzyme
Treatment

• Operatif
EFEK
• Radiasi SAMPING
• Kemoterapi
Sirsak (Annona muricata L)

 Batang dan daun memiliki zat annonaceous

acetogenins yang menunjukan sitotoksik
aktif melawan sel kanker
 Selain annonaceous acetogein terdapat
kandungan lain pada ekstrak air daun sirsak
yang berfungsi dalam menghambat
pertumbuhan tumor, yaitu flavonoid, Tannin,
dan saponins
Annonaceous Acetogenin

• Derivat rantai panjang asam lemak (C32

atau C34) dan asam carboxylic terminal
yang dikombinasi dengan 2 unit propanolol
pada posisi C2 untuk membentuk
methylsubstituted α,β-unsaturated-γ-lactone
• Salah satu struktur yang menarik adalah
tetrahydrofuran (THF) atau tetrahydropyran
(THP)
 Mekanisme kerja
1). Menghambat oksidase dari NADH di membrane plasma
pada sel kanker.
2). Menghambat komplek I (NADH : ubiquimone
oxidoreduktase) dalam system transport electron di
mitokondria, menghambat fosforilasi oksidasi dan
menghasilkan kadar ATP yang rendah
3). Menghambat sel kanker yang multidrug resistant.
Menghambat ekspresi dari plasma membrane pump, P-
glycoprotein
4). Annonacin mampu mengistirahatkan siklus sel pada fase
G1 dan menghambat progresi fase S, sebagai tambahan
p53 dan p21 ditingkatkan oleh annonacin.
Tanin

• Tanin merupakan grup metabolit kedua yang

sangat komplek yang larut dalam larutan
• Terdiri dari tanin condensed dan hydrolysable
• Hydrolysable tanin memiliki kemampuan dalam
menghambat sel tumor dengan mekanisme
menghambat langsung aktivitas MMP-2/-9 atau
dengan memblok jalur ERK-MAP kinase
Flavonoids

• Flavonoids merupakan bagian dari grup besar

kandungan polifenol yang sangat banyak pada
buah-buahan dan sayuran
• Flavonoid dapat menstimulasi aktivitas enzim
sehingga akan menginduksi siklus sel arrest dan
apoptosis, mengatur fungsi dari imun tubuh dan
menghambat inflamasi, proliferasi dan
angiogenesis
Saponin

• Saponins merupakan kelompok dari glycoside

yang mengandung steroidal atau triterpenoid
aglycone yang mana berikatan pada satu atau
lebih rantai sakarida
• Saponins memiliki kemampuan sebagai
antikanker lewat beberapa mekanisme
• Pada penelitian in vitro dan in vivo diketahui
bahwa saponins memiliki efek sitotoksik melawan
pertumbuhan sel tumor
RT-PCR

• RT-PCR merupakan metode yang sensitif dan

kuat untuk deteksi dan kuantifikasi dari ekspresi
mRNA
• Terdapat dua langkah dalam RT-PCR, yaitu
reaksi reverse transcriptase dan amplifikasi PCR
 mRNA

cDNA

Denaturasi
Cara
melihat
ekspresi Annealing Amplifikasi
gen
Elongasi

Kualitifikasi elektroforesis

Kuantifikasi Scion Image

Subjek Penelitian

• Sel HeLa
• Dilakukan sebanyak 12 sampel yang terbagi
menjadi 4 perlakuan
• Penentuan jumlah sampel tiap kelompok
didasarkan pada formulasi Gomez
• Jumlah minimal sampel yang akan digunakan
untuk penelitian ini adalah 3 buah sampel untuk
setiap kelompok perlakuan.
Kriteria Inklusi dan Eksklusi

Inklusi: Eksklusi:
• Kultur sel HeLa yang • Terjadi perubahan morfologi
tidak terkontaminasi
• Telah subconfluent
Bahan penelitian

• Daun sirsak (Annona muricata L.)

• Sel HeLa
• Medium sel : RPMI-1640 (Gibco),
Fetal Bovine Serum/FBS 10% (Gibco),
Fungison 0,5% (Gibco), penisilin dan
streptomisin 1% (Gibco)
• Primer Human Caspase 3 (272bp)
Sense primer : 5’-AAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3’
Antisense primer : 5’-GCATACTGTTTCAGCATGGCAC-3’
Denaturasi pada 94°C selama 30 detik, annealing pada 60°C selama 30 detik,
dan primer ekstensi pada 72°C selama 30 detik. Dilakukan sebanyak 30
siklus

• Primer GAPDH (kontrol positif) (354bp)

Sense primer : 5’-AGAACATCATCCCTGCCTC -3’
Antisense primer : 5’-GCCAAATTCGTTGTCATACC -3’

Denaturasi pada 94°C selama 1 menit, annealing pada 60°C selama 30 detik,
and primer ekstensi pada 72°C selama 30 detik. Dilakukan sebanyak 23
siklus
• Kit Isolasi RNA( TriPure Isolation Reagen,
Ronche)
• Kit RT-PCR (Ronche)
• Bahan pembuatan gel : Buffer TAE, Agarose,
Etidium Bromida
• Larutan buffer
• Isopropanol
• Diethylpyrocarbonat (DEPC)
• RNase – free water of DEPC – treated 0,5% SDS
Alat Penelitian

• Sentrifus
• Inkubator CO2
• Laminar air flow cabinet (Nuaire)
• Tabung conical steril (Nuclone)
• Tissue culture flask (Nuclone)
• Mikroplate 24 sumuran (Nuclone)
• PCR
• Elektroforesis
• Scion image
• Densitometer
Metode Penelitian
• Rancangan Penelitian
Eksperimental murni in vitro
• Definisi konsep Varibel
Variabel terikat
Variabel bebas
Variabel terkendali
• Perlakuan Percobaan
• Prosedur Penelitian
 Pembuatan Ekstrak Daun sirsak
 Penumbuhan Sel HeLa Subconfluent
 Pemberian ekstrak air daun sirsak
 Pengukuran Ekspresi Gen Caspase 3
a) Isolasi RNA
b) RT-PCR
c) Elektroforesis
• Analisis Data
ANOVA Post Hoc Pearson Test
• Aspek Etika Penelitian
• Lokasi penelitian
• Waktu penelitian
Alur Penelitian