Oleh: Purwadi, M.

Si

Disampaikan pada kuliah Kromatografi, UTB 2009

Elusi
Kromatografi Cair (KC)
• Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak
cairan

Bagaimana fase diamnya?

Jawab
Bisa padat bisa juga cair
Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi
Gas hanya 10%, mengapa ?

Karena Kromatografi Cair

1. Mempunyai banyak mekanisme pemisahan
2. Tidak ada persyaratan analit harus menguap,
sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik
didih relatif tinggi
3. Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan)
4. Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt
5. Tidak harus mahal: KLT, KKt
Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak

Kromatografi

Fase gerak gas Fase gerak cair

Kromatografi Krom. KLT Krom. KCKT Kroma-

Gas Kolom Kertas totron

KK. KK.
Terbuka Vakum
Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi
jenis peralatan ?
Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti
berbeda dengan KCKT?

Jawab
Jenis peralatan tidak mempengaruhi
mekanisme pemisahan secara
kromatografi Cair

Terkadang mekanisme pemisahan dalam

KLT sama dengan KCKT
 ADSORBSI

KCKT
PARTISI

KLT PERTUKARAN ION

KROM. ION
Krom. Kertas Mekanisme
PASANGAN ION
Krom Kolom
SIZE EXCLUSION

Kolom FILTRASI GEL

PERMEASI GEL
Mengapa begitu banyak mekanisme?
Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi
mempunyai bermacam mekanisme?

Jawab
Tidak, dalam satu kromatografi “hanya” terdapat satu
mekanisme saja
Misal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme
Adsorbsi
Misal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme
partisi
Farktor apa yang mendasari kita memilih satu
mekanisme pemisahan dalam kromatografi?

Jawab
Yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan
dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin
dipisahkan
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI ADSORBSI

Untuk analit yang bagaimana?

Jawab: untuk analit yang polar

Bagaimana prinsipnya:
Adsorbsi dan desorbsi
Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsi

Jawab
Anda ingat like disolve like, seperti itulah
mekanismenya

Perjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase

diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)
Berdasarkan perjanjian tersebut
Jika fase diam Polar, kemudian
Ada campuran analit, dengan
sifat Polar dan lainnya non
polar, maka yang bersifat polar
akan disukai oleh fase diam
(dengan kata lain teradsorbsi
lebih kuat) dibanding analit lain
yang kurang polar.

Analit Lebih
polar m = fase gerak
s = fase diam (polar)
Cerita mekanisme adsorbsi

Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam,

selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit
tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih
polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga
polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding
analit yang kurang polar.

Sehingga => terjadi pemisahan

Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi
1. Digunakan untuk pemisahan analit yang
bersifat polar
2. Fase diam yang digunakan bersifat polar:
misal Silika dan Alumina
3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi
4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika
pada KLT atau pun KCKT dll maka
mekanismenya adalah adsorbsi
 Kolom HPLC fase normal

 Silica
gel : pemakaian umum
 Cyano : pemakaian umum
 Amino : analisa gula
 Diol : analisa protein
-Si-CH2CH2CH2CN
Si -Si-CH2CH2CH2NH2
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Si
Silica gel
Modifikasi Si
Kasus: Suatu Campuran berisi

Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan

fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai
Rf lebih tinggi??
Jawab
Ikatan hidrogen
Non-polar

Silica gel (polar)

Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut
dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?

kuat
HO
SiOH

SiOH

lemah

OH
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI PARTISI

Untuk analit yang bagaimana?

Jawab: untuk analit yang Non-polar

Bagaimana prinsipnya:
partisi
Apa yang dimaksud dengan partisi?

Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi

jika analit dimasukkan dalam corong pisah
yang berisi dua cairan yang tidak saling
larut? Analit tersebut setelah terjadi
kesetimbangan sebagian akan masuk ke
cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke
cairan dua.
Apakah bisa fase diam berupa cairan?
Jawab: bisa

Apakah tidak terjadi abrasi jika terkena aliran

fase gerak?
Jawab: bisa.

Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi?

Jawab: cairan tersebut ditambatkan dalam
padatan
Bagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36
sebagai fase diam?
Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan
padatan silika.

-Si-C18H35

Si
 Perjanjian:
Kromatografi partisi: menggunakan fase
diam non polar, dan fase gerak polar

Sistem kromatografi dengan menggunakan

fase diam non polar, dan fase gerak polar
dikenal sebagai fase balik
Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi
menjelaskan pemisahan kedua analit beikut?

A B

Jawab:
Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar.
Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B
dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi
masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase
gerak. Senyawa B akan terparisi lebih banyak dalam fase
diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan
tertahan lebih lama pada fase diam
 Bagaimana interaksi?

Interaksi
hidrofobik Solven polar

Non-polar
 Hidrofobisitas

 Jika sampel memiliki

– CH3CH2CH2--- : rantai karbon
– : gugus aromatis
Hidrofobisitas
Jadi lebih kuat.

 Jika sampel memiliki

– -COOH : gugus karboksil
– -NH2 : gugus amino
Hidrofobisitas
– -OH : gugus hidroksil
– X jadi lebih lemah.
Waktu retensi dan Hidrofobisitas

OH

C18 (ODS)
lemah

kuat
OH
Pengaruh fase diam

C8

Medium
C18 (ODS)
sampel
kuat C4
sampel
lemah
sampel
Mekanisme pemisahan untuk
melekul ionik
Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan untuk
analit ion?

Kromatografi pasangan ion

Kromatografi penekanan ion
Kromatografi pertukaran ion
Kromatografi Pasangan Ion

Apa dasar pasangan ion?

Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi beberapa

mekanisme, jika hal tersebut terjadi maka dapat
mengakibatkan pemisahan tidak baik, misalnya terjadi
pengekoran dan atau puncak pecah.
Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara
dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga
mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak
partisi dengan sedikit adsorbsi
Kromatografi Fase Terbalik
dengan pasangan ion

Ion-Pair Reagent
Untuk apa dipasangkan?

Jawab.
Agar molekul analit netral sehingga bersifat non polar.
Ingat: PARTISI: Pemisahan senyawa non polar dengan
fase diam non polar (misal C-18)
 Reagen Ion-Pair

 Untuk Analit bersifat Anion, maka pasangannya:

– Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)
 Untuk Analit bersifat Kation, maka pasangannya:
– Butanesulfonic acid sodium salt (C4)
– Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)
– Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)
– Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)
– Octanesulfonic acid sodium salt (C8)
– Decanesulfonic acid sodium salt (C10)
 Ion Pairing
Separation of Carboxylic Acids

Column: Bonded C18

Mobile Phase: H2O/MeOH
1:1 with Tetrabutyl-
Ammonium Hydroxide
 Pasangan Ion
Hal yang penting diperhatikan

 Tipereagen Ion-Pair
 Konsentrasi reagen Ion-Pair

 pH solven

R-COOH RCOO- + H+
(pKa=4.5)
R-NH2 + H+ R-NH3+
(pKa=6.0)
 Tipe reagen ion-pair

Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate

Mobile Phase: H2O/MeOH

1:1,with 0.005M ion pairing
reagent and 1% HOAc

1 Maleic Acid
2 Phenylephrine
3 Phenylpropanolamine
4 Naphazoline
5 Phenacetin
6 Pyrilamine
 Mekanisme: Penukar ion

Jika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion

Kekuatan antar ion

R
N+ R Sampel
R
Jika analit kation maka fase diam anion, fase gerak kation

+ + + + +
+
SO
- Sampel +
3 +
+ + + + +
 Penukar ion

 Lingkungan biologi
(protein, peptide, amino acid analysis)
 Kromatografi ion

– Penukar kation
• Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3-)
• Week Cation Exchange (WCX) (R-COO-)
– Penukar anion
• Strong Anion Exchange (SAX) (R4N+)
• Week Anion Exchange (WAX)(DEAE)
 Hal yang perlu diperhatikan
pada Kromatografi Penukar ion

 pH larutan dapar
 Konsentrasi larutan dapar

 Metoda elusi
– Elusi Isokratik
– Elusi gradien pH
– Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik
 Mekanisme pemisahan
berdasarkan ukuran molekul
 Apakah SEC ?

 Size Exclusion Chromatography

(SEC)
– GPC (Gel Permeation Chromatography)
• terutama untuk sampel polimer
– GFC (Gel Filtration Chromatography)
• terutama untuk sampel biologi
 Prinsip SEC

 Tidak ada kekuatan interaksi

 Perbedaan waktu tempuh
 SEC
 Fase diam: partikel berpori
 Molekul ber BM besar

 Molekul relatif besar tidak dapat dijebak

oleh fase diam, akibatnya waktu tambat
singkat
 Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase
diam, akibatnya waktu tambat lama
 Hubungan antara
Bobot molekul & waktu tambat

Batas eksklusi
Berat molekul (LogMW)

Batas permeasi
Kolom
GPC

Waktu
Kromatografi Afinitas
 Pustaka
SusanR.Mikkelsen and Eduardo Corton, 2004,
BIOANALYTICAL CHEMISTRY, A
JOHNWILEY&SONS, INC., PUBLICATION,
New Jersey.

PT. Ditek Jaya. Presentation for Shimadzu LC