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Disciplina: Toxicologia

Prof. Msc. Fabio Vidal


1. INTRODUÇÃO

• Espécies reativas do oxigênio (ERO)


- Processos fisiológicos: crescimento celular
normal, morte celular programada e senescência
celular
- Radicais livres = sinalização celular redox (são
essenciais)
- Alta concentração  respostas deletérias ao
organismo.
1. INTRODUÇÃO

• Espécies reativas do oxigênio (ERO)


- Participam indiretamente de processos
metabólicos em doenças não como agentes mas
gerando respostas.
- Reações inflamatórias, transdução de sinal
(segundo mensageiro  funções celulares)
- Equilíbrio entre a formação/remoção de espécies
radicalares = manutenção nos mecanismos
celulares dependentes
1. INTRODUÇÃO

• Espécies reativas do oxigênio (ERO)


- Desiquilíbrio
diminuição dos antioxidantes endógenos
(menor formação ou maior consumo)
aumento de espécies oxidantes
- Desiquilíbrio = estado pró-oxidante  lesões
celulares  morte celular
1. INTRODUÇÃO

• Espécies reativas do oxigênio (ERO)


- a espécie radicalar que amplifica a primeira lesão
é desconhecida  dificulta a farmacoterapia
- Dificulta a ação do antioxidantes em eliminá-lo,
reação com alvos celulares ou interrompam
cadeias radicalares ≠ lesões celulares
- Planejamento de fármacos: processos
dependentes de radicais livres, fontes geradoras,
identificar compostos antioxidantes
2. Radicais Livres e ERO

2.1 Fundamentos
Radical Livre = qualquer espécie química capaz
de existir independentemente, que contenha um ou
mais elétrons não pareados ocupando orbitais
atômicos ou moleculares.

Todo átomo ou molécula que possua na sua


orbital externa um elétron não pareado
recebe o nome de radical livre
2. Radicais Livres e ERO

2.1 Fundamentos Redução = ganho de e-


O2 Oxidação = perda

número atômico é 8, com sua distribuição de elétrons Superóxido

composto estável com 12 elétrons na última camada (L)


2. Radicais Livres e ERO

2.1 Fundamentos Instáveis;

Meia-vida curta (nanosegundos e


alguns minutos);

Reagem com diversos compostos e


alvos celulares;

Fissão homolítica de uma ligação São formados pela perda ou adição de


química covalente; um e- a um composto não radicalar;
Radiólise da água
2. Radicais Livres e ERO
2.1 Fundamentos
O e- livre (caracteriza o radical livre)  O, N, C, S
Ex.: O2 , •NO (óxido nítrico)  fator de relaxamento dependente do
endotélio (FRDE)
- O2 bi-radical (dois e- livres nos orbitais antiligantes)  reage com
moléculas com configuração semelhante

- maioria das biomoléculas não são bi-radicais  restrição em reagir


 alvos celulares sejam lesadas

- Origina = ERO (Espécies Reativas do Oxigênio)  absorção de


energia ou transferência de e-
2. Radicais Livres e ERO
2.1 Fundamentos
 O2 + absorção de En = oxigênio singlete (-O2), delta, sigma  espécies
eletronicamente excitadas  a restrição de configuração desaparece e o
poder oxidante aumenta

 ERO  redução unieletrônica do O2 à água  entrada de 4 e-  radical


superóxido (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroxila (•OH)

 Alta [ERO] = toxicidade do oxigênio


2. Radicais Livres e ERO
2.1 Fundamentos
 O2 + absorção de En = oxigênio singlete (-O2), delta, sigma  espécies
eletronicamente excitadas  a restrição de configuração desaparece e o
poder oxidante aumenta

 ERO  redução unieletrônica do O2 à água  entrada de 4 e-  radical


superóxido (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroxila (•OH)

 Alta [ERO] = toxicidade do oxigênio


2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos

- Citoplasma
- mitocôndrias
- retículo endoplasmático
- membrana celular
- núcleo
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos

Representação das reações


envolvidas nas oxidações
fotossensibilizadas dos tipos
I e II
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos

Oxigênio singlete (1O2)


3O (oxigênio triplete) + En térmica/fotoquímica  pigmentos
2
sensibilizadores iluminados

clorofila, bilirrubina, retinal e porfirinas + irradiadas (λ) = estado


triplete  En ao 3O2  1O2
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos

Ânion-Radical Superóxido (O2-)


- auto-oxidação
- Reações enzimáticas  organelas celulares
- Hemoglobina, mioglobinas e catecolaminas
- Iniciador e propagador de cadeias radicalares
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Ânion-Radical Superóxido (O2-)
- Xantinas oxidases, NADPH oxidases e flavinas desidrogenases
- Nos microssomas, o sistema NADPH-citocromo P450
redutase/citocromo P-450  metabolismo de xenobióticos
- Células fagocíticas (ativação da NADPH oxidase)
- Importantes na destruição de microrganismos invasores
- Respiração celular  reduzido a água (pela transferência de e-
através do complexo do citocromo oxidade)
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Ânion-Radical Superóxido (O2-)
- 1 a 2 % de O2 nas mitocôndrias  superóxido (pela transferência
direta para o O2 (ubiquinona/NADN desidrogenase)
- Tensão/pressão parcial de O2  % de O2 no ar
inspirado/aumento da pressão total = maior geração de ERO 
lesões em tecidos
- Oxidante fraco  poder redutor
- Não atravessa as membranas, usa canais iônicos
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Peróxido de Hidrogênio
- Qualquer sistema que produz superóxido  peróxido de
hidrogênio (dismutação), salvo se o superóxido for intercalado
por outra substância

- Dismutação de superóxido em mitocôndrias e microssomas


2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas biológicos
Peróxido de Hidrogênio
- Xantinas oxidase (enzimas citoplasmáticas),
- succinato desidrogenase e ácido graxo desidrogenase
(mitocondriais)
- lactato oxidase, urato oxidase, D-aminoácido oxidase
(peroxissomais)
- Geram peróxido de hidrogênio diretamente
- Bacterias/micoplasmas  peróxido de hidrogênio  atravessam
membranas
- Oxidante fraco  oxida tióis/AA  inativam enzimas
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Radical Hidroxila (•OH)
- Radiações ionizantes
- Interações entre metais de transição, superóxido, peróxido de
hidrogênio
- Radiólise  alta [H2O]  exposição às radiações de raios X e
gama  radical hidroxila pela hidrólise da água
- Ultra-sonicação de soluções aquosas e ondas de alta energia
usadas em litotripsia •OH in vitro
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Radical Hidroxila (•OH)
- Em sistemas biológicos a velocidade das reações é baixa  in
vivo, metabolizada por metais de transição, Fe (Reação de
Fenton), mantido na forma reduzida por agentes redutores
- Cobre e Ferro estão em abundância no organismo
- Complexos com ADP, ATP e citrato
- Salvo: ligado a transferrina e lactoferrina em pH fisiológico não
participa da geração do radical hidroxila
- No entanto, na ferritina  agentes redutores (superóxido ou
ascorbato)  radical hidroxila
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Radical Hidroxila (•OH)
- Extremamente reativo
- Meia-vida curta = age rápido em alvos celulares  pode
comprometer DNA, proteínas, açúcares e lipídeos
- ferril (FeO2+) e perferril (Fe3+O2-) espécies formadas do Fe com
superóxidos
- Ozonização da água e dissociação do peroxinitrito
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Óxido Nítrico e Peroxinitrito
- Células endoteliais  espécie radicalar  (•NO)  fator de
relaxamento dependente do endotélio (FRDE)
- NO  segundo mensageiro  relaxamento dos vasos sanguíneos
 regulação da função imune e neurotransmissor
- Excesso = lesivo (isquemia)
- Síntese NO sintases  catalisam a oxidação de um N da
guanidínico da L-arginina  óxido nítrico e citrulina
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Óxido Nítrico e Peroxinitrito
- NO sintases constitutivas (isoformas I e II) --> células endoteliais
e células do tecido nervoso  Ca e calmodulina como co-fatores
- NO sintase indutivas (isoforma II) não requer Ca e calmodulina
como co-fatores  NO  citocinas e endotoxina em
macrófagos, células endoteliais vasculares, células musculares
lisas vasculares, neutrófilos e miócitos cardíacos
- Superóxido dismutase  NO pela NO sintase in vitro acelerando
a conversão de um intermediário da via L-arginina a NO.
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Óxido Nítrico e Peroxinitrito
- LDL  aumenta a liberação de NO em cultura de células
endoteliais de aorta de colhos
- Acetilcolina, serotonina, ATP, bradicinina  influxo de Ca
mediado por receptor  produção e liberação extracelular
- Após liberado  interage com o grupo heme da guanilato ciclase
 GMPc e relaxamento das células musculares lisas vasculares
- Vasorrelaxante, inibe agregação plaquetária, inibe a proliferação
de células do músculo liso e modula a proliferação de células
endoteliais microvasculares
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Óxido Nítrico e Peroxinitrito
- Decomposição  nitrito e nitrato (indicadores de produção
celular)
- Meia-vida = 4 a 50 s  2x em superóxido dismutase
- O efeito da enzima  remoção do ânion radical superóxido 
evitando a reação deste com o óxido nítrico para formar
peroxinitrito (ONOO-) ou pela oxidação do ânion nitroxila (NO-)
a óxido nítrico
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Óxido Nítrico e Peroxinitrito
- Superóxido e óxido nítrico  reagem soluções aquosas  ânion
peroxinitrito  esse ânion mais sua forma protonada tem meia-
vida curta (t ½ < 1 s) em pH fisiológico
- O ácido peroxinitroso  pode sofrer rearranjo intramolecular 
nitrato (NO3-) decompor-se hemoliticamente em radical (OH•) ou
dióxido de nitrogênio (•NO2) independentes de metais
- Ânion peroxinitrito  reage com cobre no sítio ativo da CuZn-
superóxido dismutase = forte agente de nitração
2. Radicais Livres e ERO
2.2 Geração de espécies reativas em sistemas
biológicos
Óxido Nítrico e Peroxinitrito
- Peroxinitrito e sua forma protonada (ácido peroxinitroso,
ONOOH) potentes oxidantes  lipoprotreínas/lípides de
membranas
- Reagem com ácidos graxos de membranas e lipoproteínas 
notrolípides (ácidos graxo insaturados com nitrados) 
sinalizadores celular em concentração fisiológica.
- Interação com proteínas = nitrotirosinas (adição de grupo nitro
NO2 na posição orto da tirosina)  catalisada por metais de
transição e superóxido dismutase  células inflamatórias
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
Ácido graxo Radical livre
Reações radicalares

Peroxidação Peroxil
lipídica
Hidroperóxido lipídico

alcoxil

Composto
Estado triplete Carnonílico

Estado fundamental Álcool


3. Antioxidantes e sistemas de defesa
- Inibe a oxidação
- Ainda que em baixa [ ] diminui/ inibe a oxidação
do substrato
- Compostos que protegem sistemas biológicos 
contra os efeitos potencialmente danosos de
processos/reações  oxidação de
macromoléculas
- Sistema de defesa antioxidante  várias
substâncias em diferentes níveis
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
- Defesa primária = substâncias que impedem a produção de ERO
- Ou, possuem ação “sequestrante”, impedem cadeia radicalar
Enzimas antioxidantes,
Quelantes e proteínas (transferrina e ceruloplamina) 
ferro/cobre  impedem formação de ERO
Substâncias não enzimáticas (urato, ascorbato, albumina,
bilirrubina e carotenoides  superóxidos e hidroxila X -O2
- Defesa secundária:
 Compostos fenólicos, amainas aromáticas  bloqueiam etapas
de propagação da cadeia radicalar X (Peroxil/alcoxil)
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
- Defesa primária = substâncias que impedem a produção de ERO
- Ou, possuem ação “sequestrante”, impedem cadeia radicalar
Enzimas antioxidantes,
Quelantes e proteínas (transferrina e ceruloplamina) 
ferro/cobre  impedem formação de ERO
Substâncias não enzimáticas (urato, ascorbato, albumina,
bilirrubina e carotenoides  superóxidos e hidroxila X -O2
- Defesa secundária:
Compostos fenólicos, amainas aromáticas  bloqueiam etapas
de propagação da cadeia radicalar X (Peroxil/alcoxil)
Tocoferois (Vitamina E), tocotrienois, flavonoides, sintéticos
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
- Terceira linha de defesa
Sistemas de reparo de DNA
PROETASES
FOFOLIPASES

- Removem lesões oxidativa do DNA, proteínas e lipídeos


3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3. 1 Enzimas Antioxidantes
SOD, GPx, catalase
- Catalisa a dismutação do radical peróxido
- Fe-SOD = PROCARIOTOS
- CuZn-SOD, Mn-SOD = EUCARIOTOS  citoplasma celular
- EC-SOD = tetramérica = 4 átomos de cobre e zinco  células
endoteliais (fluidos extracelulares)
- Mn-SOD  enzima mitocondrial
- CuZn-SOD  em alta conc. Em eritrócitos do que me
plaquetas/plasma
- SOD = fígado > cérebro > testículos > rins > coração > estômago >
pulmão > pâncreas
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3. 1 Enzimas Antioxidantes

- GPx  catalisa a redução de hidroperóxidos orgânicos e inorgânicos


(H2O2)  pela glutationa reduzida (GSH)  formando glutationa
oxidada (GSSG) e água (ou álcoois)
- Glutationa redutase + NADPH (da via das pentoses)
- 2/3 de sua atividade está no citoplasma
- 1/3 nas mitocôndrias
- Nos diversos órgãos: fígado > rins > pâncreas > cérebro > coração >
pulmão > baço > músculos esqueléticos
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3. 1 Enzimas Antioxidantes
- Catalase  peroxissomos do fígado e rins e em microperoxissomos de
outras células
- Hemeproteina (grupos heme)
- Especificidade para H2O2
- alta concentração no fígado e baixa nos eritrócitos
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3.2 Ascorbato
Plantas/animais  ácido ascórbico  glicose
- Dieta
- Co-fator de enzimas (hidroxilases de prolina e lisinas)  síntese de
colágeno e dopamina-beta-hidrolxilase (dopamina para adrenalina)
- Baixo potencial de redução = age como antioxidante
- Ascorbil = estresse oxidativo
- Importante para manter o radical tocoferil e alfa-tocoferol
(antioxidantes) em membranas
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3.3 Glutationa (GSH)
- Tripeptídeo de resíduos de glicina, cisteína e ácido glutâmico
- Sequestrador de hidroxila e oxigênio singlete
- Influencia a quebra de eritrócitos
- Co-fator de varias enzimas (glutationa peroxidase, glioxilase,
maleilacetoacetato isomerase e prostanglandina endoperoxido
isomerase)
- Processos de desintoxicação (conjugação glutationa-S-transferase, e
remoção do peroxido via glutationa peroxidase)
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3.4 Tioredoxinas

- Procariontes/eucariontes
- Reduzem ligações disulfeto (S-S) em ditióis (2 grupos -SH)
- Tioredoxina redutase
- Reduz estresse oxidativo e aumento de oxido nítrico
- Preservando função endotelial
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3.5 Melatonina
Indolamina  glândula pineal, olhos, outros tecidos
Modula funções do sistema endócrino e circadiano
Sequestram OH
Modula a expressão gênica de enzimas antioxidantes
3.6 Metalotioneínas
Rins, fígado, intestino
Ricas em cisteínas, capazes de ligar íons metálicos
Armazenamento de metais pesados
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3.7 Antioxidantes lipossolúveis
- Tocoferóis (Vitamina E)
- Ubiquinonas
- Carotenoides
- Protegem contra lipoperoxidação
- Componentes redox em transportes de elétrons e cadeia respiratória
- Supressores de oxigênio singlete e sequestradores de radicais livres
3. Antioxidantes e sistemas de defesa
3.8 Antioxidantes dos fluidos extracelulares
Baixa [ ] de catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase

3.9. Sistemas de Reparo


DNA não replicante interage com histonas  proteção

4. Estresse Oxidativo
Desiquilíbrio  aterosclerose, envelhecimento, lesões por isquemia e
perfusão, doenças auto-imune e inflamações crônicas,
5. Estratégias e Intervenção Terapêutica
Compostos sequestradores de radicais livres como potenciais agentes
terapêuticos

Grupos tiol
Agentes complexantes de metais de transição
Compostos fenólicos de plantas
Inibidores de oxido nítrico sintase
Captadores de spin
Antioxidantes enzimáticos (superóxido dismutase)
Fármacos: Probucol, alopurinol,