5991-5411ES Agilent LC Theory Spanish

Cromatografía
de líquidos
de alto rendimiento
(HPLC):
fundamentos y teoría
CONSTRUYENDO
UNA CIENCIA MEJOR
ENTRE AGILENT Y USTED
Exclusivamente para fines educativos

May 9, 2018
© Agilent Technologies, Inc. 2016
1
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May 9, 2018
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Introducción
La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas

en inglés), anteriormente denominada cromatografía de líquidos de alta
presión, es una técnica en el campo de la química analítica utilizada para
separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla.
En la HPLC se utilizan bombas para hacer pasar un disolvente líquido
presurizado mezclado con la muestra a través de una columna rellena de
un adsorbente sólido. Cada componente de la muestra interactúa de forma
ligeramente diferente con el adsorbente, lo que hace que los distintos
componentes presenten velocidades de flujo distintas y posibilita
la separación de los componentes a medida que salen de la columna.

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Índice
Introducción Ecuación de Van Deemter

• ¿Qué sucede en el interior de la columna? • Difusión turbulenta
Parámetros clave • Difusión axial
• Tiempo de retención y anchura de pico • Resistencia a la transferencia de masa
• Resolución: separación en la línea de base • Más información sobre la ecuación de Van
Deemter
• Resolución: ecuación fundamental
• Eficiencia o número de platos teóricos Capacidad de picos
• Análisis en gradiente
• Factor de retención
• Definición
• Selectividad o factor de separación
• Cálculo de la capacidad de picos
¿Cómo se puede influir sobre la
• Anchura de pico
selectividad?
• Ejemplo
• Selectividad: ejemplo n.º 1
• Número de platos

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Introducción
¿Qué sucede en el interior de la columna?
Tiempo (t)
Separación (tr2-tr1)
Anchura de pico (Wb1,2)
Índice
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Introducción
tr2-tr1 tr2-tr1
Separación de mayor calidad frente a Separación de menor calidad
Wb1 Wb2 Wb1 Wb2
Separación de mayor calidad frente a Separación de menor calidad

Índice
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Introducción
t r 2  t r1
Rs 
1 / 2  (Wb 2  Wb1 ) Tiempo (t)
La resolución indica la capacidad de

una columna para separar los picos
Separación (tr2-tr1)
de interés.
Anchura de pico (Wb1,2)
Permite conocer si se ha conseguido la
separación en la línea de base o no.
Índice
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Parámetros clave
Tiempo de retención y anchura de pico
h
tr2
tri Tiempo de retención
del compuesto "i"
tr1 W1/2 Anchura de pico a
la mitad de la altura
Wbi Anchura de pico
en la línea de base
W 1/2
W b1 W b2
t
Índice
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Parámetros clave
Resolución: separación en la línea de base
h
La resolución indica la capacidad de una
columna para separar los picos de interés. Rs = 1,5
Sobre la resolución influyen la eficiencia (N),
la selectividad (a) y la retención (k).
• Debe tener como mínimo un valor igual a 1
para que se produzca una separación medible
y se pueda realizar una cuantificación
adecuada.
• Se necesita un valor igual a 0,6 para que se
pueda distinguir un valle entre dos picos de la t
misma altura.
• Para los métodos más robustos normalmente
se requieren valores iguales o superiores a 1,7.
• Se considera que un valor igual a 1,6 se
corresponde con una separación en línea de
base y garantiza unos resultados cuantitativos
de precisión máxima.
Índice
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Parámetros clave
Resolución: ecuación fundamental de la (U)HPLC
a 1  k 
Rs  1 N     
4  a  1 k 
Eficiencia Selectividad Retención
La resolución se puede aumentar mejorando cualquiera de esos parámetros:

• La selectividad es el parámetro con mayor influencia sobre la resolución.
Con pequeñas variaciones de selectividad se pueden conseguir grandes
cambios en las resoluciones.
• La retención únicamente influye de manera significativa cuando el valor
del parámetro k es bajo.
• La eficiencia indica el poder de separación de la columna.
Índice
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Parámetros clave
Resolución: ecuación fundamental de la (U)HPLC
La selectividad tiene una influencia máxima sobre la resolución:
• Cambio de la fase estacionaria.
• Cambio de la fase móvil.
Es la forma más sencilla de aumentar
el número de platos.
En la figura se muestra la resolución en función de la selectividad,

la eficiencia de la columna y la retención.
Índice
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Parámetros clave
Eficiencia o número de platos teóricos (N)
2 2
 tr   tr 
N  16    N  5,54   
 Wb   W1/ 2 
La eficiencia de la columna se utiliza para comparar el rendimiento de diferentes
columnas. Se expresa por medio del número de platos teóricos (N).
Las columnas con un número alto de platos son más eficientes. Una columna
con un valor N alto generará picos más estrechos para un determinado tiempo
de retención que una columna con un valor N más bajo.
Parámetros que influyen sobre la eficiencia de la columna:
• Longitud de la columna (a mayor longitud, mayor eficiencia).
• Tamaño de partícula (a menor tamaño de partícula, mayor eficiencia).
Índice
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Parámetros clave
Factor de retención (k)
 t r  t0 
k   
 t0 
El factor de retención mide el tiempo que un componente de la muestra

permanece en la fase estacionaria en comparación con el tiempo que
permanece en la fase móvil. Se calcula dividiendo el tiempo de retención
entre el tiempo de un pico no retenido (t0).
Parámetros que influyen sobre el factor de retención:
• Fase estacionaria
• Fase móvil
• Pendiente del gradiente*
• Volumen muerto del sistema*
Índice
* Únicamente para la elución en gradiente.

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Parámetros clave
Factor de retención (k): eluciones en gradiente
tG  F
k  `
S    Vm
Esta ecuación indica la influencia sobre el factor de retención de la
velocidad de flujo (F), el tiempo del gradiente (tG), el rango del gradiente
(ΔΦ) y el volumen de la columna (Vm).
Recuerde: Para mantener constante el factor de retención, los cambios
en el denominador se deben compensar con cambios proporcionales
en el numerador y viceversa.
Índice
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Parámetros clave
Selectividad o factor de separación (α)
k2 a Selectividad
a k1 Factor de retención del primer pico
k1 k2 Factor de retención del segundo pico
La selectividad es una medida del tiempo o la distancia entre los máximos

de dos picos. Si α = 1, ambos picos tendrán el mismo tiempo de retención
y se coeluirán. Se define como la relación de los factores de capacidad.
Parámetros que influyen sobre el factor de retención:
• Fase estacionaria
• Fase móvil
• Temperatura
Índice
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Parámetros clave
Influencia de N, α y k sobre la resolución
Índice
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¿Cómo se puede influir sobre la separación?
Muestra idéntica analizada con diferentes fases estacionarias,
pero con la misma temperatura, fase móvil y gradiente.
Índice
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Muestra idéntica analizada con la misma fase estacionaria y
temperatura, pero con diferentes fases móviles (mismo gradiente).
Índice
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Muestra idéntica analizada con la misma fase estacionaria y fase móvil,
pero con diferentes temperaturas (mismo gradiente).
Índice
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¿Qué es un “plato” en HPLC?
Lc 1 Lc
Rs ~ 1 N Rs ~ 1 ~
4 4 H 4 h d
p
LC Longitud de la columna
dp Tamaño de partícula
h Altura reducida de un plato teórico
Un plato teórico es la etapa hipotética en la cual dos fases de una

sustancia (fase líquida y fase vapor) se encuentran en equilibrio.
Índice
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Un número de platos (N) alto aporta las siguientes ventajas:

• Picos agudos y estrechos
• Mejora de la detección
• Capacidad de picos que permite analizar muestras complejas
No obstante, la resolución únicamente aumenta de forma proporcional
a la raíz cuadrada del número de platos.
• RS ~ N
Asimismo, el aumento del número de platos viene limitado por las
condiciones experimentales.
• Por ejemplo, el tiempo de análisis y la presión.
Índice
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Interrelación: anchura de pico y altura reducida de un plato teórico
tr1  tr 2 Lc
Rs  Rs ~ 1
1 / 2  ( Wb 2  Wb1 ) 4 h d
p
h  f (w )
h  f ( w eddy  w ax  w C )
h: altura reducida de un plato teórico
Índice
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Ecuación de Van Deemter
Difusión turbulenta
wturb ~ λ dp λ: Calidad del relleno de la columna
Diferencias en las vías de difusión causadas por:
Trayectorias diferentes Relleno deficiente Distribución amplia de

de la columna tamaños de partícula
Índice
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Difusión axial o longitudinal
Aumento de la anchura de pico debido a la autodifusión del analito.
Si existe un flujo reducido, el analito permanece en la fase móvil durante
un tiempo prolongado.
• Notable aumento de la anchura de pico.
• Mayor altura de plato teórico.
Flujo
Índice
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Resistencia a la transferencia de masa
wC ~ dp2
Diferentes trayectorias de difusión
Partícula porosa
Capa estacionaria de fase móvil
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La ecuación de Van Deemter expresa las variaciones por unidad de longitud

de una columna de separación en función de la fase móvil lineal, de forma
que tiene en cuenta las propiedades físicas, cinéticas y termodinámicas
de una separación (fuente: Wikipedia).
h = f (wturb + wax + wC) • Difusión turbulenta

• Coeficiente de difusión
h = A + B/u + C u • Resistencia a la transferencia
de masa
Índice
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h = A + B/u + C u
Altura reducida de un plato teórico (h)
Curva total (Van Deemter)
Resistencia a la transferencia
de masa
Difusión turbulenta
Difusión axial
Flujo
Índice
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Medidas con diferentes tamaños de partícula
• Las partículas pequeñas
reducen la altura de los
platos teóricos y, por
tanto, aumentan la
eficiencia de la
separación.
5,0 m
• En el caso de las
partículas de menor
tamaño, la eficiencia de
3,5 m
la separación se ve
menos afectada al
aumentar el flujo. 1,8 m
• Específica para
compuestos e
instrumentos concretos.
• La velocidad de flujo
óptima depende del
compuesto
Índice
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Capacidad de picos
Análisis en gradiente
Altura reducida del plato teórico

h  f (w 2 ) en función de la anchura de pico
Análisis isocrático:
La anchura de pico depende exclusivamente de los procesos de difusión.
Análisis en gradiente:
La anchura de pico depende de los procesos de difusión y del gradiente,
sobre todo en la cabeza de la columna.
Índice
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Capacidad de picos
Definición
La capacidad de picos es el número de picos (n) que se pueden separar
en un determinado tiempo con una determinada resolución.
La capacidad de picos depende de diferentes factores, como la longitud
de la columna y el tamaño de partícula.
Capacidad de picos: 32 picos en 2,5 min
Índice
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Capacidad de picos
Cálculo de la capacidad de picos
wav Anchura media de los picos
tG tG
P 1  1  n Número de picos
1 n

w av tG Tiempo del gradiente
w w Anchura del pico seleccionado
n 1
tG
Simplificación: P 1 
w
Índice
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Capacidad de picos
Anchura de pico
Anchura de pico a la mitad de la altura
Anchura de pico al 5 % de la altura

Anchura de pico al 4,4 % de la altura (5σ)
Anchura de pico según el método de la tangente

Índice
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Capacidad de picos
Ejemplo
mAU
Columna: 2,1 x 150 mm, 1,8 µm
Retropresión: 402 bar
60
Capacidad de picos: 313
40
20
10 20 30 40 50 min
mAU
Columna: 2,1 x 300 mm*, 1,8 µm
50 Retropresión: 598 bar
Capacidad de picos: 406
40
30
20
10
20 40 60 80 100 min
Índice * Columna de 300 mm obtenida mediante la unión de dos columnas de 150 mm.

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Más información
Para obtener más información sobre los productos de Agilent, visite los sitios web
www.agilent.com y www.agilent.com/chem/academia.
¿Tiene alguna consulta o sugerencia en relación con esta presentación?
Escriba a academia.team@agilent.com
.
Publicación Título N.º pub.
Manual técnico The LC Handbook 5990-7595EN
The influence of silica pore size on efficiency, resolution and loading in Reversed-Phase
Nota de aplicación 5990-8298EN
HPLC
Nota de aplicación Increasing resolution using longer columns while maintaining analysis time 5991-0513EN
Study of physical properties of superficially porous silica on its superior chromatographic
Póster
performance
Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC system using
Nota de aplicación 5990-6933EN
gradient parameters
Nota de aplicación Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC 5990-6932EN
Nota de aplicación Increased peak capacity for peptide analysis with the Agilent 1290 Infinity LC system 5990-6313EN
CHROMacademy (acceso gratuito a los cursos online para estudiantes y personal
Sitio web
universitario)
Índice
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GRACIAS
POR SU
ATENCIÓN
Índice 5991-5411ES

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Abreviaturas
Abreviatura Definición Abreviatura Definición

α Selectividad t Tiempo
dp Tamaño de partícula tr Tiempo de retención
ΔΦ Rango del gradiente t0 Tiempo muerto de la columna
F Velocidad de flujo tG Tiempo del gradiente
h Altura reducida de un plato teórico Vm Volumen de la columna
(medida del poder de resolución de w Anchura de pico
una columna)
W 1/2 Anchura de pico a la mitad de la altura
k Factor de retención, anteriormente
conocido como factor de capacidad (k') W bi Anchura de pico en la línea de base
wturb Difusión turbulenta
Lc Longitud de la columna
λ Calidad del relleno de la columna wax Difusión axial o longitudinal
N Eficiencia o número de platos de la wC Resistencia a la transferencia de masa

columna wav Anchura media de los picos
P Capacidad de picos
R Resolución
Índice
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Cromatografía

Exclusivamente para fines educativos

Este conjunto de diapositivas ha sido preparado por Agilent

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La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas

Exclusivamente para fines educativos

Introducción Ecuación de Van Deemter

Exclusivamente para fines educativos

Separación de mayor calidad frente a Separación de menor calidad

Wb1 Wb2 Wb1 Wb2

Separación de mayor calidad frente a Separación de menor calidad

La resolución indica la capacidad de

Eficiencia Selectividad Retención

La resolución se puede aumentar mejorando cualquiera de esos parámetros:

En la figura se muestra la resolución en función de la selectividad,

El factor de retención mide el tiempo que un componente de la muestra

Exclusivamente para fines educativos

La selectividad es una medida del tiempo o la distancia entre los máximos

Un plato teórico es la etapa hipotética en la cual dos fases de una

Un número de platos (N) alto aporta las siguientes ventajas:

h: altura reducida de un plato teórico

wturb ~ λ dp λ: Calidad del relleno de la columna

Diferencias en las vías de difusión causadas por:

Trayectorias diferentes Relleno deficiente Distribución amplia de

La ecuación de Van Deemter expresa las variaciones por unidad de longitud

h = f (wturb + wax + wC) • Difusión turbulenta

Curva total (Van Deemter)

Altura reducida del plato teórico

Capacidad de picos: 32 picos en 2,5 min

Anchura de pico a la mitad de la altura

Anchura de pico al 5 % de la altura

Anchura de pico según el método de la tangente

Exclusivamente para fines educativos

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Abreviatura Definición Abreviatura Definición

N Eficiencia o número de platos de la wC Resistencia a la transferencia de masa

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