SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

OLEH:
TIM KIMIA ANALISA INSTRUMEN
Tujuan :
Mengetahui Prinsip Dasar UV-Vis
Mengetahui Instrumen dan Alat yang digunakan
Mengetahui penggunaan UV-Vis dalam Analisis
Spektrofotometri UV/Vis
Spektrofotometri UV/Vis
adalah teknik analisis
spektroskopi yang
memakai sumber radiasi
elektromagnetik ultra
violet dekat (190 nm – 380
nm) dan sinar tampak (380
nm – 780 nm) dengan
menggunakan instrumen
spetrofotometer.
Spektrum elektromagnetik dan sinar visibel

4
Prinsip dasar spektrometri UV/Vis
Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis
adalah interaksi yang terjadi antara energy
yang berupa sinar monokromatis dari
sumber sinar dengan materi yang berupa
Spektrofotometri
molekul. UV-Vis merupakan penyerapan
sinar tampak atau UV oleh suatu molekul yang
dapat menyebabkan terjadinya eksitasi elektron
(transisi elektronik) dari keadaan dasar (ground
state) menuju energi yang lebih tinggi (excited
Prinsip
state).dasar dalam spektrofotometer UV-Vis
adalah ketika suatu cahaya atau energy mengenai
larutan jernih, maka energi tersebut akan
ditansmisikan atau diabsorbsi. Besarnya nilai
KEGUNAAN SPEKTROFOTOMETER UV-VIS

Spektrometer UV-VIS pada umumnya

digunakan untuk :
1. Menentukan adanya gugus kromofor dan
ikatan rangkap yang terkonyugasi dari suatu
senyawa organik
2. Mengetahui informasi dari struktur dengan
membandingkan koefisien ekstinsi molar
3. Untuk analisa kuantitatif
Transisi elektronik
Molekul yang mengabsorpsi cahaya akan menyebabkan eksitasi elektron
dari keadaan dasar ke keadaan eksitasi.
Eksitasi ini hanya terjadi jika energi yang tersedia sesuai dengan perbedaan
tingkat energi dari keadaan dasar dan keadaan terksitasi atau bersifat
karakteristik.

Gugus-gugus fungsional organik tidak jenuh yang mengabsorbsi sinar tampak

dan UV dinamakan kromofor atau sering dikenal dengan pembawa warna.
Contoh kromofor seperti –NH2, -C=C-, C=O, -CHO, -NO2, -N=N- dan lain-lain
 Eksitasi elektronik

• Penyerapan sinar (energi) UV dan Vis oleh molekul suatu

zat organik :
 disebabkan oleh eksitasi elektronik (Dyer,2)
 melibatkan promosi elektron pada orbital σ,  dan n
dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih
tinggi (Dyer,5)
• Transisi elektronik () yang dilibatkan pada daerah UV
dan Vis adalah tipe-tipe berikut (Dyer,6) :
σ  σ*, n  σ*, n  *, dan   *
Yang paling banyak pada daerah UV : transisi yang
melibatkan elektron orbital n dan * (Miller,153)

8
warna yang teramati Warna yang diserap Panjang gelombang

Green Red 700 nm

Blue-green Orange-red 600 nm

Violet Yellow 550 nm

Red-violet Yellow-green 530 nm

Red Green 500 nm

Orange Blue 450 nm

Yellow Violet 400 nm

 Analisis Kualitatif (1)
Serapan sinar UV/Vis ditentukan oleh (Shimadzu, 4.4.1)
- Kromofor : gugus fungsional yang menyerap sinar
a.l : >C=C<, >C=O, -N=N-, -N=O, ← mempunyai multiplet
bonding (Shimadzu,4.4.1)
-NO2, -C=C- (Miller,154)

Kromofor biasanya mengandung “ bond” (Miller,153)

- Ausokrom : gugus fungsional yang tidak mempunyai serapan
a.l : -OH, -NH2, -SH (dan ← punya pasangan elektron yang tidak
derivatnya), dan terikat (Shimadzu,4.4.1)
beberapa halogen (Dyer,11)
Jika terikat dengan kromofor, gugus ini biasanya menyebabkan
pergeseran serapan ke arah  yang lebih besar dan
meningkatkan intensitas puncak serapan (Dyer,10-11)

10
 Analisis Kualitatif (2)
Applikasi spektrofotometri UV-Vis untuk keperluan
analisis kualitatif adalah sangat terbatas karena pita
serapan cenderung lebar dan karenanya informasi
yang diberikan kurang detail. Walaupun demikian,
investigasi terhadap spektra pada daerah ini
seringkali memberikan informasi yang berguna
mengenai ada tidaknya gugus fungsional (misalnya
karbonil, aromatis, nitro, atau diena terkonyugasi)
pada suatu senyawa organik (Skoog,80-81)

Spektra serapan UV/Vis sering digunakan pada saat

mengidentifikasi spesies molekuler. Ini sering
dilakukan dengan cara membandingkan spektrum
spesies zat sampel dengan spektrum zat yang telah
diketahui (berasal dari spektra literatur) (Settle,497)
11
 Informasi Analisis pada range UV-Vis (a) (Kellner,531-532)

In the UV-Vis range from 200-700 nm typical (khas)

cromophores (light absorbing groups) can be observed;
groups with n  *,   * transitions in molecular
orbitals, d-d transitions in ligand fields of metal chelates
and charge-transfer bonds.

The omnipresent (keberadaan) σ-bonds in organic

compounds and also the non conjugated (isolated)
double bonds and n  δ* transitions are not excited in
the normal UV-Vis range and thus do not interfere

12
 Informasi Analisis pada range UV-Vis (b) (Kellner,531-532)
Absorption maxima of some Absorption maxima of nonconjugated
conjugated chromophores chromophores
max max
Substances Chromophore Transition
(nm) (nm)
CH3-CO-CH=CH2 225 -C-C- σ  σ* 150
CH2=CH-CH=CH2 217 -O- n  σ* 185
CH3(CH=CH)3CH3 274 -N< n  σ* 195
CH3(CH=CH)5CH3 342 -S- n  σ* 195
CH3(CH=CH)7CH3 401
>C=O   * 190
C6H6 203
n  * 300
C6H5-CH=CH2 248 (weak)
>C=C<
13   * 190
Analisis Kualitatif (4)
Pergeseran serapan maksimum ke arah  yang
lebih panjang  pergeseran batokromik
(=pergeseran merah) (Settle,486;Miller,155)
Pergeseran ini dapat disebabkan oleh terikatnya ausokrom pada
kromofor (Miller,155;Williams,7) atau perubahan pelarut (Williams,7)
Pergeseran serapan maksimum ke arah  yang
lebih pendek  pergeseran hipsokromik
(=pergeseran biru) (Settle,486;Miller,155)
Pergeseran ini dapat disebabkan oleh perubahan pelarut (makin polar)
atau substituen pada molekul (Miller,155-156), atau fenomena seperti
hilangnya konyugasi (Williams,7)
Kenaikan instensitas serapan, misalnya karena terikatnya ausokrom pada
kromofor atau efek pelarut (makin polar)  efek hiperkromik
(Miller,155-156)

Penurunan instensitas serapan  efek hipokromik

(Settle,155,486;Williams,7)

14
 Analisis Kuantitatif (1)
Untuk keperluan kuantitatif :
• diperlukan ε maks besar

agar konsentrasi larutan uji encer/kecil
• larutan uji biasanya sangat encer (c ≤ 0,1 mol/L) (Kellner,528)
 1 mg (jika BM 100-200) dilarutkan hingga 100 ml (Williams,2)
Jika pekat  yang dipantulkan
yang dihamburkan  besar, sedangkan
yang diserap yang diteruskan : kecil
Yang dibutuhkan,
yang diteruskan : besar
• nilai maksimal serapan (A) adalah 1,0
 A yang digunakan : 0,2 – 0,8 [0,2 - 0,650 (Willard,90)]
atau T : 15 – 75%
Angka ini dipilih untuk meminimalkan
15 “errorr” dari alat
 Analisis Kuantitatif (2)

Untuk mengetahui apakah “daerah kerja” memenuhi hukum

Lambert-Beer,

 dibuat kurva baku

Kurva baku digunakan jika “r hitung > r tabel”

kurva baku  jaminan kita bekerja dengan larutan encer

yang memenuhi hukum Lamber-Beer

16
 Analisis Kuantitatif (Settle,498) (3)
Ada beberapa tehnik analisis yang dikembangkan untuk jenis
sampel berlainan. Penentuan secara langsung dilakukan jika
molekul analit memiliki suatu kromofor. Standar harus
digunakan untuk menentukan absorbsivitas sehingga
konsentrasi dapat dihitung dengan persamaan berikut
A = a.b.c
or by establishing acalibration plot from which the
concentration can be determined by graphic interpretation or
by regretion analysis.
Penentuan secara tidak langsung umumnya dilakukan jika
molekul analit tidak memiliki “a suitable chromophore”.
Dalam hal ini, analit direaksikan secara kuantitatif dengan
molekul yang memiliki suatu kromofor and correlating the
diminution of absorbance with the concentration of the
analyte, atau dengan mereaksikannya dengan suatu reagen
yang dapat membentuk suatu gugus kromofor.
17
 Hukum Lambert-Beer (1)
Cara menyatakan hukum Lambert-Beer :

T = I / Io = transmitan A = log (Io/I) = absorbansi

(serapan)
- log (I/ Io) = a.b.c log (Io /I) = a.b.c
- log T = a.b.c A = a.b.c

Seringkali a dinyatakan dalam ppm (mg zat/1 L larutan).

Jika c dinyatakan dalam mol per liter, dan b dalam cm,
 a diganti dengan ε (koefisien ekstingsi molar, =
molar absorptivitas = absortivitas molar)
(Dyer,5;Settle,487;Fritz,70-71)

dan selanjutnya persamaan Lambert-Beers menjadi

- log T = ε.b.c atau A = ε.b.c
18
 Hukum Lambert-Beer (2) (Kellner,528)
A=ε.b.c
dimana
A : Absorbansi (= serapan)
ε : molar absorptivitas (L mol-1 cm-1)
c : kosentrasi larutan (mol/L)
b : tebal sel ≈ tebal kuvet ≈ tebal larutan (cm)
nilai c biasanya hanya untuk larutan encer (c ≤ 0,1 mol/L)
Jadi, Serapan (A) proporsional dengan konsentrasi larutan
zat (c) dan ketebalan sel (b)

19
 Hukum Lambert-Beer (3)
Jika BM suatu zat tidak diketahui, atau jika yang
ditetapkan berupa campuran (Williams,8), intensitas serapan
dinyatakan sebagai E 1%
1 cm atau A 1 cm , serapan larutan zat
1%

1% dalam kuvet 1,0 cm. Hubungannya dengan ε (Dyer,5):

10 ε = 1%
E 1 cm X mol. berat

Contoh perhitungan serapan :

1%
E 1 cm 325 nm = 30
Berdasarkan persamaan diatas (Williams,8):
nilai serapan atau log (Io/I) larutan adalah 30;
diukur terhadap larutan dengan kadar 1% dan
ketebalan larutan 1 cm, pada  325 nm
20
Hukum Lambert-Beer (4) (Skoog,87)

Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap spektrum

serapan suatu zat :
- pelarut
- pH larutan
- suhu
- konsentrasi elektrolit yang tinggi
- zat asing yang mengganggu

21
 Pelarut (1)
• Harus dapat melarutkan zat uji dan meneruskan
radiasi pada daerah  yang digunakan (Pecsok,153)
• Senyawa hidrokarbon jenuh dan senyawa yang hanya
memiliki gugus alkil jenuh, gugus alkohol, dan gugus
eter adalah transparan (tidak memberikan serapan)
pada daerah 200-1000 mµ
 dapat digunakan sebagai pelarut pada penentuan
spektra yang melalui daerah ini (Dyer,8-9)
• Pelarut paling umum untuk penentuan spektrum UV
adalah etanol 95% (Dyer,4)
Etanol absolut komersial mengandung residu benzen
yang memberikan serapan pada daerah UV (Williams,2)

22
 Pelarut (2)

• Air dan heksana juga sering digunakan (Dyer,4)

• Perbedaan pelarut dapat menggeser posisi puncak
serapan (Dyer,4). Serapan maksimum dalam larutan etanol
terjadi pada  yang lebih panjang dibandingkan dalam
larutan heksana (Diktat, 31)

Pergeseran merah  sekitar 10-20 nm,

dari pelarut heksana ke etanol (Diktat,
31)

Panjang gelombang maksimum ( maks) untuk senyawa

nonpolar umumnya sama dalam pelarut alkohol dan
heksana;  maks untuk senyawa polar biasanya berbeda
(bergeser) (Dyer,4)

23
 Pelarut (Kellner,532) (3)

Solvent can interact strongly with certain solutes and

thus change the observed UV-Vis spectra, either

by removing vibrational fine structure, or

by shifting absorption band maxima, or
both

24
Pelarut (4)

25
Pelarut (5a)

26
Pelarut (5b)

27
Pelarut (5c)

28
 H. Tahapan Kerja Analisis (1)
1. Mencari “Operating Time” (OT)
Tujuan :
mengetahui waktu dimana suatu proses reaksi
berlangsung stabil
Pada saat reaksi berlangsung stabil (=pada saat OT)
 diukur serapan larutan uji
Pengukuran pada saat reaksi berlangsung tidak stabil
 data yang diperoleh tidak menentu
Bagaimana mencari dan mengetahui OT ?

29
 H. Tahapan Kerja Analisis (2)
2. Mencari  maksimum (maks)
Tujuan :
memperoleh serapan maksimum
Serapan maksimum diperoleh jika pengukuran dilakukan
pada maks
Perubahan serapan per unit konsentrasi pada maks adalah
sangat besar (Skoog,87)
“ semua yang terserap larutan uji idealnya juga terukur
maksimal oleh spektrofotometer “ sehingga diperoleh hasil
uji yang maksimal.
maks harus dicari walaupun dalam prosedur
aslinya biasanya juga telah disebutkan (petunjuk,14)
Bagaimana mencari dan mengetahui maks ?

30
31
 H. Tahapan Kerja Analisis (3)
3. Membuat kurva standar
a. Dibuat dari satu seri larutan standar - menggunakan
zat standar - dalam berbagai kadar
Zat standar = zat yang diuji (terdapat dalam larutan uji)
b. Diukur serapan satu seri larutan standar pada OT dan
 maks yang diperoleh pada tahap 1 dan 2.
Serapan tiap-tiap kadar larutan standar dicatat, dicari
persamaan garis lurus dan koefisien korelasinya;
absis (X) untuk konsentrasi (c) larutan standar,
ordinat (Y) untuk serapan (A)

32
Kurva kalibrasi

33
34
 H. Tahapan Kerja Analisis (4)
4. Mencari kadar zat dalam larutan uji
a. Larutan uji dalam kuvet yang telah dipersiapkan
diukur serapannya pada OT dan  maks yang
telah diketahui.
Dilakukan beberapa kali pengulangan pengujian
(4 replikasi).
b). Dengan bantuan kurva standar atau persamaan
garis linier yang diperoleh dapat diketahui kadar
zat dalam sampel.

35
 I. Instrumen (1)
Spektrofotometer
provide a plot of the intensity of transmitted or absorbed
light versus wavelength (Dyer,4;Settle,488)
Penggolongan berdasarkan sistem optik
-- single beam
Sistem optik -- -- single detector
-- double beam --
-- double detector
Pada double beam,
sumber cahaya utama terbagi menuju 2 beam :
satu menuju kuvet (mengandung larutan sampel) dan satu
menuju kuvet (mengandung pelarut referensi) (Dyer, 4)
Yang dimiliki Lab Pendidikan Kimia UNRI?

36
I. Instrumen (2)

37
I. Instrumen (3)

38
I. Instrumen (Settle,489) (4)

39
Sumber sinar

40
41
• Filter atau monokromator
Ada beberapa cara untuk mengisolasi/mendapatkan
sinar monokromatik yang diinginkan. Salah satunya
adalah dengan menempatkan suatu filter di depan wadah
sampel
 filter dapat berupa glass filter atau gelatin filter (Wratten),
yang mempunyai bandwidths yang luas dan puncak emisi
yang rendah (Hicks,26)
[Bandwidth (nm) glass filter : 150+, gelatin filter : 25-50;
Transmisi (%) glass filter : 25-90%, gelatin filter : 5-30
(Beckett,227)]

Beberapa instrumen menggunakan prisma atau diffraction

gratings sebagai monokromator (Settle,490).

42
Skema monokromator
prisma (Pecsok,150)

43
 Sampel

Sampel (molekul, ion) yang diuji pada daerah UV

atau Vis biasanya berupa gas atau larutan dan
ditempatkan dalam sel atau kuvet (Pecsok,153,226)

44
 Kuvet
Untuk Vis  dari gelas atau kuarsa (quartz) (Pecsok,153;Kellner,530)

Untuk UV  harus dari kuarsa (Fritz, 77; Dyer, 4)

Gelas menyerap sinar UV dengan kuat (Dyer,4)

Kuvet biasanya mempunyai panjang celah 1,0 cm (Dyer,4;Skoog,50)

Kuvet dari kuarsa atau gelas dapat dibersihkan dengan dibilas
dengan air; jika perlu, dengan larutan deterjen atau
asam nitrat panas (Pecsok,153)
Dibilas dengan etanol agar cepat kering
Dibilas untuk mencegah terjadinya penumpukan zat yang
mengabsorbsi, pada permukaan kuvet (Settle,497)

45
46
K. Blangko (Hicks dkk., 22-23; Gearien,139)

• Serapan yang terukur oleh spektrofotometer tidak

hanya serapan solut dalam larutan uji melainkan juga
semua molekul yang dilewati sinar. Karenanya dibuat
blangko, untuk mengkoreksi pantulan, hamburan dan
penyerapan oleh kuvet dan konstituen pada larutan uji.
Blangko dibuat dengan menempatkan konstituen
(pelarut, reagen, dll) yang digunakan pada larutan uji,
ke dalam kuvet. Dengan larutan blangko selanjutnya
rekorder diatur pada posisi T = 100% atau A = 0, pada
 pengujian serapan solut. Setelah itu baru dilakukan
pembacaan serapan solut dalam larutan uji.
Dengan demikian, serapan konstituen dalam larutan uji
yang diukur dapat diabaikan.

47
Detektor

48
49
 Aplikasi UV/Vis (Harvey, 395-398)

• Bidang lingkungan
(misal : analisis berbagai logam dalam air)
• Bidang klinik
(misal : analisis barbiturat dalam serum)
• Bidang industri
Bidang industri farmasi : analisis antibiotika, hormon,
vitamin, analgesik)
Bidang industri lain : analisis makanan, cat, gelas, logam
• Bidang Forensik
(misal : analisis narkotika, alkohol dalam darah) 50
 Bagan Spektrofotomer UV-ViS berkas tunggal

Sumber Mono Kuvet Detektor Pencatat

Sinar kromator sampel Ampli
penguat
 Bagan Spektrofotomer UV-ViS Berkas rangkap

Sumber Mono Kuvet Detektor Pencatat

Sinar kromator sampel Ampli
penguat

Blanko
Spektrofotometer
Spektrofotometer

 Sumber cahaya (Lampu) : memancarkan semua warna

cahaya (yaitu, cahaya putih).
 Monokromator : memilih satu panjang gelombang dan
panjang gelombang yang dikirimkan melalui sampel.
 Detektor : mendeteksi panjang gelombang cahaya
yang telah melewati sampel.
 Amplifier : meningkatkan sinyal sehingga lebih mudah
untuk baca terhadap kebisingan latar belakang.
 Komponen : lampu
 Lampu
 Spektrofotometer UV
1. Lampu Gas hidrogen
2. Lampu Merkuri
 Spektrofotometer Visible
Lampu Tungsen
Spektrofotometer UV-Visible
Photodiode
 1. Sumber Radiasi

• Argon 100 – 160 nm

• Tungsten 350 – 800 nm
• Deuterium 160 – 360 nm
• Xenon 200 – 900 nm
 Komponen : monokromator
• Cahaya
– Semua cahaya
– Cahaya polikromatik
 Komponen : monokromator
• Monokromator  memilih cahaya
monokromatik
– Cahaya satu warna

Cahaya merah
yang diserap
oleh larutan
hijau
 3. Monokromator

PRISMA
GRATING
 Komponen : sample cells
 Sample cells (kuvet)
 Spektrofotometer UV
Quartz (crystalline silica)
 Spektrofotometer Visible
Glass
2. Kuvet (Sample Container)
 4. Detektor

Photovoltaic

Phototube

Diode array
 Struktur kimia dan absorpsi UV

Larutan yang dapat dianalisis dengan

spektrofotometer UV  senyawa yang mempunyai
gugus kromofor
Gugus kromofor : gugus molekul yang mengandung
sistem elektronik yang dapat menyerap energi pada
daerah UV
 Struktur Kromofor
Group Structure nm
Karbonil >C=O 280
Azo -N = N- 262
Nitro -N=O 270
Thioketon -C =S 330
Nitrit -NO2 230
Diena terkonjugasi -C=C-C=C- 233
Triena terkonjugasi -C=C-C=C-C=C- 268
Tetraena terkonjugasi -C=C-C=C-C=C-C=C- 315
Benzena 261
Aplikasi spektrofotometer UV

Protein
Amino Acids (aromatic)
Glucose Determination
Enzyme Activity (Hexokinase)
 Struktur kimia dan absorpsi Visible
Larutan yang dapat dianalisis dengan
spektrofotometer visible  senyawa yang berwarna
Contoh : KMnO4
Apabila senyawa tersebut tidak berwarna, maka perlu
ditambahkan pengompleks yang dapat membentuk
warna
Contoh : analisis logam Pb
Aplikasi spektrofotometer visible

Niacin
Pyridoxine
Vitamin B12
Metal Determination (Fe)
Fat-quality Determination (TBA)
Enzyme Activity (glucose oxidase)
• Penentuan konsentrasi sampel :
• Ukur panjang gelombang maks
• Buat kurva standar
• Ukur sampel
• Konversi A sampel dengan kurva standar