CAPITULO 6

CRECIMIENTO
MICROBIANO
 CRECIMIENTO MICROBIANO
INTRODUCCION
• Incremento ordenado de todos los constituyentes
celulares.
• Aumento de masa y finalmente a un aumento en el
número de células
• En bacterias (fisión binaria)

• Para que el crecimiento bacteriano tenga lugar es

necesario un aporte adecuado de nutrientes:
Carbono, Nitrógeno, Oxígeno, Hidrógeno, Azufre,
Fosforo y diversos minerales y nutrientes especiales
para crecer
 CRECIMIENTO MICROBIANO
INTRODUCCION
• En el caso de microorganismos se considera:
 El crecimiento individual que equivale al
crecimiento celular(CICLO CELULAR)
 El crecimiento colectivo o CRECIMIENTO DE
POBLACIONES.

 Se toma como base el crecimiento de bacterias, el estudio

puede servir también para entender el crecimiento de
levaduras y hongos.
 El crecimiento de una población resulta de la suma de los
ciclos celulares de todos los individuos de dicha población.
• Ciclo celular : proceso de desarrollo de una bacteria
aislada.
DIVISIÓN CELULAR: FISIÓN BINARIA
Para que la división celular tenga lugar se ha de formar un tabique o septo ,
que separe la célula original en dos células hijas(fisión binaria). Cada una de
ellas recibe un cromosoma completo y la porción correspondiente de
citoplasma.

Gemación,
ej.
levaduras
REQUERIMIENTOS, FACTORES PARA EL CRECIMIENTO
MICROBIANO

REQUERIMIENTOS FISICOS

 Temperatura
 pH
 Actividad de Agua
 Presión Osmótica
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DEL CRECIMIENTO Y LAS
CONSECUENCIAS MOLECULARES PARA LA CÉLULA
 MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
ANAEROBIOS ESTRICTOS Y ANAEROBIOS AEROTOLERANTES

Estrictos (2): crecen en atmósferas con

una tensión de oxígeno inferior al 0,5%.
Mueren en presencia de cantidades
mayores.

Aerotolerantes (5): pueden sobrevivir

en presencia de oxígeno (hasta un 8%),
pero son incapaces de utilizarlo para su
metabolismo.

La tolerancia viene determinada por la

presencia de enzimas: superoxido
dismutasa (SOD), catalasa y peroxidasa
que catalizan la conversión de radicales
superóxido a peróxido de hidrógeno,
menos tóxico, y a oxígeno molecular.
REQUERIMIENTOS QUIMICOS

Carbono
Nitrógeno
Azufre
Fosforo
Oligoelementos
Oxígeno
Carbóno (C) todos los organismos requieren C para sintetizar los componentes celulares.

Nitrógeno, azufre.y fósforo. Estos elementos se requieren para la síntesis de DNA, RNA,
proteínas y ATP. Las bacterias pueden obtener nitrógeno (N) ya sea fijándolo directamente de la
atmósfera, como por ejemplo el género bacteriano Rhizobium. También pueden obtener este elemento
de compuestos inorgánicos que contengan N como nitritos, nitratos, sales de amonio o amino ácidos.
Las bacterias pueden obtener azufre de iones de sulfato, sulfito de hidrógeno y amino ácidos con azufre.
El fósforo es esencial para la síntesis de ácidos nucleicos y membranas celulares. Una fuente para
obtener fósforo son los iones de fosfato y el ATP.

Elementos trazas. Otros elementos como hierro, cobre, molibdeno y zinc son requeridos por los
microorganismos en pequeñas cantidades. Usualmente tienen función de cofactores.

Oxígeno No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas formas de vida requieren
oxígeno para llevar a cabo respiración aeróbica. Los microorganismos que utilizan oxígeno molecular son
llamados aeróbicos. Estos se clasifican en aeróbicos obligados que son los que requieren oxígenos
molecular para vivir, y los aeróbicos facultativos los cuales utilizan el oxígeno molecular cuando está
presente, pero en su ausencia continúan su crecimiento por la vía de fermentación o respiración
anaeróbica, un ejemplo es Escherichia coli. Por otro lado tenemos los anaeróbico obligados que
necesitan ausencia de oxígeno molecular para crecer y donde este generalmente es tóxico, un ejemplo
es el género Clostridium. Estos microorganismos obtienen el átomo de oxígeno molecular del agua.
También se observan microorganismos anaeróbicos aerotolerantes los cuales no utilizan el oxígenos
molecular para su crecimiento, pero pueden tolerarlo. Los microaerofílicos sólo pueden crecer en
concentraciones de oxígeno molecular menor a las encontradas en el aire.
 Macronutrientes
Fuente de - CO2
carbono - Compuestos Carbohidratos, azúcares,
orgánicos proteínas, aminoácidos,
lípidos, ácidos grasos,
glicerol
Fuente de - Inorgánica NH4, NO3-, N2
nitrógeno - Orgánica Proteínas, peptonas, aa,
bases púricas y
pirimídicas, urea
Fuente de - Inorgánica Fosfatos
fósforo - Orgánica Esteres del ácido
fosfórico
Fuente de - Inorgánica Sulfuros y sulfatos
azufre - Orgánica Aminoácidos sulfurados,
vitaminas
Tipos nutricionales Fuente de Fuente de Ejemplos
energía C
Cianobacterias,
Fotoautótrofos Luz CO2 bacterias
púrpuras y
verdes
Compuestos Algunas
Fotoheterótrofos Luz orgánicos bacterias
púrpuras y
verdes
Compuestos Algunas
Quimioautótrofos o inorgánicos CO2 Eubacterias y
litótrofos ej.: H 2, NH3, muchas Archaea
NO2-, H2S
La mayoría
Quimioheterótrofos Compuestos Compuestos Eubacterias,
o heterótrofos orgánicos orgánicos algunas Archaea
 FACTORES ORGANICOS DE
CRECIMIENTO

•Son compuestos orgánicos esenciales que el

organismo no puede sintetizar.

• Se incluyen las vitaminas, los amino ácidos, las

purinas y las pirimidinas.
 MEDIOS DE CULTIVO
CULTIVO MICROBIANO. Es el desarrollo activo de
microorganismos en medios adecuados (medios de
cultivo).
• Toda célula viva para su mantenimiento y
reproducción requiere consumir nutrientes que le
permitan realizar los procesos metabólicos
necesarios para su supervivencia.
MEDIO DE CULTIVO
• Son una mezcla de nutrientes que en
concentraciones adecuadas y en condiciones físicas
óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos.
• Pueden ser: de laboratorio, industriales
 USOS
En laboratorio.
• Desarrollo de m.o. (reproducción)
• Conservar m.o.
• Aislar m.o.
En la industria.
• Producción de biomasa.
• Producción de metabolitos
 REQUISITOS DE LOS MEDIOS
• 1. Ser nutritivos. contener los
componentes necesarios a los
requerimientos del m.o de interés
• 2. pH adecuado. La mayoría requiere pHs
neutros, pero algunos no, como
Thiobacillus ferroxidans pH=2.0
• 3. Ser estéril. para garantizar sólo el
desarrollo del ó los m.o de interés
 COMPOSICION
Deben contener los componentes
necesarios para formar las nuevas células
por ejemplo:
• Bacterias
• Levaduras
• Hongos
• Algas
• Protozoarios
 COMPOSICION
• Los hongos requieren una fuente orgánica a la
que se acompaña de antibióticos para evitar la
presencia de bacterias.
• El cultivo de microalgas requiere sales
minerales suplementadas con vitaminas.
También suelen añadirse antibióticos para
evitar la contaminación bacteriana.
• Para el cultivo de protozoos, que crecen
difícilmente en medios sólidos, se requieren
medios líquidos enriquecidos con otros
microorganismos
 CLASIFICACION. MEDIOS DE LABORATORIO
Los medios de cultivo se pueden clasificar según diversos
criterios:
Por la naturaleza de sus constituyentes:
• Medios naturales o complejos: constituidos por
sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que
son usualmente complementadas con minerales y otras
sustancias.
• Ejm. Extracto de levadura, agar-papa, extracto de maíz.
• En ellos no se conocen todos los componentes ni las
cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
• Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen
una composición química definida cualitativa y
cuantitativamente.
• Se adquieren de laboratorios proveedores.
• Generalmente se usan en trabajos de investigación.
 CLASIFICACIÓN
De acuerdo al uso del medio de cultivo:
• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el
crecimiento de un tipo de microorganismo en particular.
• Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo.
Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del
crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se
quieren cultivar.
• Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se
diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el
aislamiento de microorganismos específicos.
• Estos medios se enriquecen añadiendo sustancias que inhiban el
crecimiento de la flora no deseada.
• Un buen ejemplo sería el medio TCBS (tiosulfato-citrato-sales biliares-
sacarosa), especial para aislamiento de especies del género Vibrio, en
el que la sustancia inhibitoria son las sales biliares
• Medios diferenciales: contienen indicadores de productos derivados
de la actividad microbiana de los microorganismos.
• No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana.
Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos
 CLASIFICACIÓN
Por la consistencia del medio.
• medios líquidos son utilizados para la promoción del crecimiento. Ejm.
caldo lactosado para coliformes, caldos nutritivos,etc.
• El crecimiento se evidencia por la turbidez del tubo, si se trata de una
prueba bioquímica, además de la turbidez se observa un viraje del
indicador e inclusive en algunos casos (campanas de Durham)
producción de gas.
• medios semisólidos ( agar al 0.7%)donde la finalidad principal es
poner de manifiesto la movilidad de la bacteria en este caso la siembra
se realiza con un asa recta, por picadura y se observa si la bacteria
presenta turbidez móvil en el tubo y si no solo se ve el crecimiento a
lo largo de la picadura.
• Ejplo. Agar SIM. agarMIA, agar PCA.
• medios sólidos. también son utilizados como pruebas bioquímicas,
donde el crecimiento se observa en la superficie o pico de flauta (si es
un tubo), si se trata de una placa (la siembra puede ser masiva o estría
cruzada), es comúnmente utilizada para la obtención de colonias
aisladas del microorganismo de interés.
• Existen diferentes tipos de estos medios, diferenciales, selectivos,
nutritivos, etc.
MEDIOS SOLIDOS
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
 COMPONENTES DE LOS MEDIOS

• Fuente de carbono
• Fuente de nitrógeno
• Micro nutrientes
• Suplementos
• Colorantes e indicadores
 1. FUENTES DE CARBONO
• 1.1. Carbohidratos.
• Monosacáridos.
• Dextrosa. Presente en jugos de frutas. Hidrólisis de lactosa,
sacarosa, almidón.
• Oligosacáridos.
• Lactosa (suero de leche)
• Sacarosa.
• Dextrina.
• Polisacáridos.
• Almidón
• agar
• 1.2. alcoholes.
• Glicerol.
• Etanol
• metanol
 FUENTE DE CARBONO

• 1.3 Lípidos.

• 1.4 hidrocarburos
 2. FUENTES DE NITRÓGENO

• Nitratos
• Sales de amonio
• Hidrolizados. Peptonas. Digeridos,
extractos.
 FUENTES DE NITRÓGENO
• 1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas)
son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de
distintas fuentes proteicas como carne de diferentes
órganos y animales, pescado, caseína, gelatina, harina
de soja, algodón, girasol, etc..
Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y
variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño
de la cadena de polipéptidos.
• 2) Extracto de carne, que se obtiene por extracción
acuosa y concentración posterior variando su tipo de
acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracción y
temperatura de la misma.
 FUENTES DE N
• 3) Extracto de levadura, puede ser obtenida
mediante autólisis o plasmólisis de la levadura, es
básicamente una mezcla de aminoácidos, péptidos,
vitaminas solubles en H2O y carbohidratos.
• 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en
H2O de la malta de la cebada
• 5) "Cornsteep", el agua de maceración de la industria
del maíz tiene mucha importancia por su utilización
como componente esencial de los medios para la
producción de varios antibióticos y enzimas.
• Deben considerarse los costos, la disponibilidad y el
problema de impurezas que puede acompañar a las
distintas materias primas utilizadas.
 3. MICRONUTRIENTES
Según la cantidad pueden ser:
• Macronutrientes. En cantidades de gr/l. C, O2, H2, N2, P,
S, K, Na, Ca, Mg
• Micronutrientes.oligoelementos, en mg/l o µg/l
• Son activadores enzimaticos. Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, B.
• Se usan sales como: NaCl, KH2PO4, NH4(SO4), MnSO4,
ZnSO4, CaCl2
• El Na en altas concentraciones inhibe el crecimiento
de algunos m.o y favorece a otros. Ejplo. Agar manitol
salado (7.5% de ClNa) se usa para el crecimiento de
staphilococcus.
• Agar streptococcus KF (6.5% ClNa) para crecimiento de
streptococcus
 4. SUPLEMENTOS
A. inhibidores.
• Antibióticos. Como penicilina, estreptomicina,
cloranfenicol (amplio espectro).
• Ejm. Agar saboraoud-glucosa. Contiene cloranfenicol.
• Fungicidas: fungizona, amphotericina (mohos y
levaduras).
• Metales pesados.
• Ejmplo. Agar sulfito-bismuto. Contiene Bi y colorante
verde brillante e inhiben a bacterias Gram (+) y mayoría
de Gram (-), excepto a salmonella.
• Compuestos orgánicos inhibidores.
• Agar salmonella-shigella. Contiene altas concentraciones
de sales biliares y citrato de sodio que inhibe a las Gram
(+) y mayoría de gram(-) incluyendo a las coliformes,
excepto salmonella y shigella.
 SUPLEMENTOS
B. factores de crecimiento.
• Compuestos orgánicos que se
suministran en bajas concentraciones.
• No son sintetizados por los m.o. que se
desea favorecer, pero son necesarios
para su desarrollo.
• Vitaminas, aminoácidos, ácidos grasos.
 SUPLEMENTOS
C. colorantes e indicadores.
• Indicadores de reacción, indicadores de potencial oxido-
reductor, indicadores selectivos.
• Indicadores de la reacción del medio.
• Verde malaquita:
• pH muy ácido: amarillo
• pH =2 : verde
• pH = 11.5: azúl
• pH = 14: incoloro
• Rojo-fenol.
• pH = 7.8: azúl
• pH =7.8: púrpura.
• pH = 7.4: rojo
• oH = 7.0: naranja
• pH =6.5: amarillo.
• Para indicar producción de acidos; láctico, cítrico, acético
 SUPLEMENTOS
Indicadores del potencial de oxido-reducción.
• Azul de metileno:
• Medio oxidante: azul
• Medio reductor: incoloro
Indicadores selectivos.
• Verde malaquita, cristal violeta: inhiben bacterias
gram(+)
• Colorantes básicos: inhiben bacterias.
Ejemplo. Agar Mc-Conkey. Contiene sales biliares y cristal
violeta que inhibe a las gram(+)
• Agar EMB. Para determinación de coliformes fecales.
Contiene eosina y azul de metileno que inhiben gram(+)
y facilita el desarrollo de enterobacterias.
 PREPARACIÒN
Para su preparación se deben tener en cuenta los
siguientes aspectos:

• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una

calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
• Utilizar materiales de vidrio bien lavados y
enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada
durante su esterilización.
• Nunca se deben exceder las condiciones señaladas
por el fabricante.
• Cuidados : rehidratación, estado del material,
esterilización, almacenamiento.
 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
Se siguen las instrucciones del rótulo
del medio de acuerdo a la cantidad a
preparar.
Se transfiere el medio a un erlenmeyer
y se agrega la cantidad de agua
destilada establecida.
Con ayuda de un vagueta se
disuelven los grumos que puedan
formarse y se lleva la suspensión a
baño maría hasta que el medio se torne
transparente, se cubre el erlenmeyer
con un tapón de algodón (torunda)
envuelto en gasa.
Se cubre la torunda con material
impermeable y se esteriliza en
autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
Si se utiliza de inmediato, dejar enfriar a
temperatura alrededor de 45ºC.
En caso de que el medio solidifique,
fundirlo nuevamente a baño maría
antes de su uso.
 PREPARACIÓN
1. Rehidratación:
Usar agua destilada.
• Se añade el agar al agua a Tº ambiente, se
deja embeber unos minutos, se agita y se
calienta a 98-100 ºC hasta disolución total.
• En medios con azúcares un excesivo
calentamiento lleva a caramelización.
• Los medios agarizados con pH<5 son muy
delicados porque la acidez sumada al calor
hidroliza las moléculas de agar, haciéndose
el medio friable y quebradizo.
 PREPARACIÓN
•2. Secado de las placas.
•Para obtener colonias bien aisladas sembrar sobre placas cuya
superficie no esté húmeda.
•Poner la placa boca abajo (con el medio colgando), se coloca
la tapa de la placa abajo.
•Todo medio preparado debe almacenarse en la oscuridad, para
evitar la formación de peróxidos bacteriostáticos o bactericidas.
 PREPARACIÓN
3- Esterilización (121 ºC, 15 min.)

• En autoclave, controlar (no es lo mismo 15' a 121 ºC que

14'a 121 ºC).
• El tiempo de esterilización (tiempo a 120 °C) requerido,
para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min y
para tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de
2 L. de 30-35 min, para 125 ml es de 12-14 min.
• Un frasco pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y
una botella de suero de 9000 ml 50-55 min.

• Medios con componentes grasos, enfriar en agitación para

no formar grumos.
• Los medios con azúcares se esterilizan mejor por debajo
de 118 ºC (116 ºC, 30’), para evitar caramelización.
 PREPARACIÓN
4. Almacenamiento de medios deshidratados

• Almacenados bajo condiciones óptimas tienen

caducidad de 3 a 5 años.
• Una vez abierto el bote no usar mas de 6 meses.
• Deben permanecer en armario cerrado, sin luz,
humedad o calor (lámparas, estufas).
• Conviene lugar fresco, pero no refrigerador, porque
condensaría agua.
• Una vez preparado y esterilizado se debe
almacenar entre 2 y 8 °C, a menos que el medio
requiera alguna condición diferente.
 Agar McConkey:
Medio diferencial para detección, aislamiento y enumeración de
bacterias coliformes y patógenas intestinales.
• Acción diferencial. Los microorganismos capaces de fermentar
lactosa producen una caída de pH, junto con una absorción del
colorante, apareciendo en la colonia el color rojo, las colonias de
microorganismos que no fermentan la lactosa permanecen
incoloras.
• Composición por Litro:
– Peptona de gelatina- 17g
– Peptona de caseína- 1.5g
– Peptona de carne - 1.5g
– Lactosa- 10g
– Sales Biliares- 1.5g
– Cloruro Sódico- 5g
– Rojo Neutro- 0.03g
– Cristal Violeta- 0.001g
– Agar- 13.5g
– pH 7.1+- 0.2
 Agar Nutritivo

• Medio para fines generales que

promueve el crecimiento de la mayoría
de los microorganismos poco exigentes.
• Composición por Litro:
• Extracto de Carne de buey- 3g
• Peptona trípsica de gelatina- 5g
• Agar- 15g
• Cloruro sódico y glucosa- 5 g
• Agua destilada hasta 1000 ml
 Agar Papa Dextrosa:
• Medio para el cultivo y enumeración de
levaduras y mohos a partir de alimentos y
otros materiales. Los hidratos de carbono y la
infusión de papa favorecen el crecimiento de
levaduras y hongos, en tanto que por el bajo
rango de pH, la flora acompañante se reduce
significativamente.
• Composición por Litro:
• Agar -15g
• Dextrosa - 20g
• Infusión papa - 4g
 Agar Sabouraud
• Medio para la detección y aislamiento de hongos.
• Para que ocurra el crecimiento selectivo de
hongos sobre bacterias en la muestra depende
tan solo de la reacción ácida (pH 5.6).
• Composición por Litro:
• Digestivo pancreático de caseína- 5g
• Peptona de tejido digestivo -5 g
• Dextrosa -40g
• Agar- 15g
 PREPARACIÓN DE AGARES, EN LABORATORIO

• Agar McConkey …. 50 g/l

• Agar nutritivo ……. 20 g/l
• Agar LIA ………….…. 32 g/l
• Agar TSI ………….…. 65 g/l
• Agar EMB ………….. 36 g/l
 MEDIOS INDUSTRIALES
•Es una etapa fundamental para asegurar la
productividad de los m.o.
•Se usan siempre medios complejos
•Es conveniente considerar:
–diseño
–formulación y
–optimización de los mismos.
 A. DISEÑO DEL MEDIO

Finalidad.
•Elección de componentes necesarios para
lograr el crecimiento y la formación de
productos deseados.

Tener en cuenta:
•Requerimientos nutricionales del m.o.
•Aspectos específicos del proceso
•Disponibilidad de las materias primas.
 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Están determinados por
Macronutrientes:
• Heterotrofos, autotrofos.
• Aerobio o anaerobio. En la ausencia del O2 , el NO3 o SO4 son
utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias.
• Tipos de fuentes de N: inorgánico u orgánico.
• P y el S: Suministrados en P04 y S04 (aminoácidos azufrados).
• K y Mg. El primero suele unirse al RNA, de manera que sus
requerimientos aumentan la velocidad de crecimiento.
Micronutrientes son 2 categorías:
• a) Los frecuentemente esenciales: Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn.
• b) los raramente esenciales: B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo,
Sn.
Factores de crecimiento; ciertos aminoácidos y vitaminas del
grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotético, niacina, etc.
 OTROS AGREGADOS
Requeridos por los m.o. de manera específica
según el proceso considerado.

Ejemplo:
• Los precursores, constituyen la base de una
molécula a sintetizar. Ejemplo. ácido fenil acético
para la penicilina.
• El sulfato, en fermentación alcohólica, favorece
la formación de glicerol.
• La producción de ácido cítrico debe considerar la
influencia negativa que para el proceso tiene un
exceso de hierro en su composición.
 COSTO

El costo de los nutrientes representa del 10 al 60% del

total.
Las fuentes de carbono pueden ser:
•1) Hidratos de carbono (glucosa, sacarosa, lactosa,
almidón, dextrina)
•2) Alcoholes: glicerol y manitol
•3) Hidrocarburos: hexadecano, octadecano y otros.

•Otras materias primas que contienen hidratos de

carbono como granos, melazas, celulosas, suero de
queso, etc
 B. FORMULACIÓN

• Debe establecer las concentraciones de cada

componente.
• Una primera aproximación de las cantidades a
utilizar lo da la composición del m.o. a ser
empleado.
• Una composición elemental y típica de la biomasa
es (% peso seco):
• Carbono, 46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-3;
Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%.
 C. OPTIMIZACIÓN
Necesaria. ….
• 1) No existencia de información respecto a
coeficientes de rendimiento de macro y micro
elementos.
• 2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas,
(microelementos y factores de crecimiento).
• 3) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras
e inhibidoras del crecimiento y formación del
producto.
• 4) Empleo de fuentes nutricionales no
convencionales.

• Realizar experimentos, variando la concentración

del componente a ensayar.
 D. CUIDADOS EN LA ESTERILIZACIÓN
• El efecto del tiempo es:

• Esto es válido para el cálculo del tiempo de esterilización mínimo,

a 121 °C, en fermentadores industriales del volumen conocido.
• Además de esterilizar los medios, se debe conservar al máximo
su calidad nutriente.
• En medios definidos puede haber pérdida importante de Mg, K,
amonio, Na y fosfatos por precipitación de sales poco solubles
como MgNH4PO4, MgKP04 y MgNaP04.
• Autoclavar, sales de Ca y Mg aparte de PO4.

• Los aminoácidos(triptofano, glutamina, asparragina) y factores de

crecimiento (tiamina, riboflavina y piridoxina) son muy lábiles al
calor.
• Es aconsejable disolverlas separadamente en pequeños
volúmenes de H2O y luego esterilizarlas por filtración.
CASO APLICATIVO: CULTIVO DE LEVADURA PANERA

• Antes se usaba la levadura de cerveza.

• Primera planta de producción. Holanda, 1780
(proceso Dutch) era anaerobio con rendimiento del
4 al 6% con respecto a la materia prima usada.
• Mejoró el rendimiento, al 12-22% (proceso Vienna)
con proceso anaerobio 1846.
• Con aireación (1879), se aumenta rendimiento, a
50-60% del teórico.
• Con melazas de remolacha o de caña pueden
alcanzarse rendimientos cercanos al 100% del
teórico.
 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
• Fuentes de carbono y energía: Glucosa y sacarosa.
• Fuente de Nitrogeno: NH4, urea, sales de amonio, ó
mezclas de aminoácidos. (Nitrato o nitrito no pueden ser
asimilados).
• Macroelementos indispensables: P(ácido fosfórico), Mg
como MgSO4.
• S. cerevisiae requiere 200 ug de Zn, 75 ug de Fe y 12-15 ug
de Cu por litro de medio para crecimiento óptimo.
• Requerimientos de la biotina: 100 ug de biotina por 100 g de
azúcar.
• El ácido pantoténico, que es un componente de la coenzima
A, es también requerido por muchas especies.
• La tiamina aumenta la actividad fermentativa de la levadura.
•El Mg, S, y Zn se agregan como sulfatos
•El MgS04 se suele incorporar a razón de 1 g de la sal
heptahidratada y el Zn como 10 mg del sulfato tetrahidratado
por Kg de melaza.
COMPOSICIÓN DE LA MELAZA DE CAÑA Y REMOLACHA
 MEDIO DE PRODUCCIÓN
•La materia prima elemental es la melaza de remolacha o de caña o
ambas en conjunto. (Sacarosa es el azúcar predominante en ambas)
•La materia orgánica no azúcares en la melaza de caña son: gomas
solubles y ácidos orgánicos sobre todo aconítico y compuestos
nitrogenados.
•En melaza de remolacha los orgánicos no azúcares son: betaína,
ácido glutámico y algunos ácidos orgánicos como láctico, málico,
acético y oxálico.
•En las cenizas predomina en ambas melazas el K
•Mayor % de fósforo y biotina en melaza de caña que en remolacha.
•El contenido de pantotenato de Ca, y compuestos nitrogenados
asimilables en la remolacha.
•Los fabricantes prefieren, si tienen disponibilidad, utilizar mezclas de
ambas.
•Las melazas se utilizan generalmente diluidas al 50%.
•Componentes extraños (que pueden afectar el rendimiento):
algunos pesticidas, como lindane, aldrin, heptaclor, dieldrin, etc.
•Si se utiliza melaza de remolacha es indispensable agregar biotina
 MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOS

• Para conseguir una recuperación óptima de bacterias

anaerobias es fundamental elegir correctamente los
medios de cultivo primarios.
• La mayoría de estas bacterias requieren para su
crecimiento vitamina K1 y hemina.
• Para su aislamiento e identificación presuntiva se
aconseja utilizar una combinación de medios
enriquecidos no selectivos, selectivos y diferenciales
 MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS
ANAEROBIOS
Para su aislamiento e identificación presuntiva se aconseja
utilizar una combinación de medios enriquecidos, como:

Un medio de agar sangre para anaerobios como agar

Brucella o agar Schaedler con un 5% de sangre de
carnero, a los que se añaden vitamina K1 (1 µg/ml) y
hemina (5 µg/ml).
 MEDIOS Y METODOS PARA CULTIVOS ANAEROBIOS
•Agar con yema de huevo (AYE). Cuando se sospecha la
presencia de clostridios, para detectar la producción de lipasa y/o
lecitinasa.

• Un agar selectivo para Clostridium difficile, cuando se investigue

la presencia de esta especie, como agar fructosa-cicloserina-
cefoxitina (CCFA) o agar yema de huevo-cicloserina-cefoxitina
(CCEY).

• Como medio líquido de enriquecimiento o de mantenimiento se

recomienda usar caldo de tioglicolato sin indicador, suplementado
con vitamina K1 (200 µl) y hemina (20 µl).
Este medio se utiliza para recuperar las bacterias anaerobias en
caso de que falle la anaerobiosis en la incubación de los cultivos
primarios, haya una inhibición del crecimiento debido a
antibióticos o a otros factores, o bien cuando las bacterias se
encuentran en cantidades muy pequeñas.
Sistemas de incubación en anaerobiosis.
El oxigeno se elimina promoviendo su reacción con el Hidrógeno,
para lo cual hay catalizador, Paladio.
Se coloca un sobre conteniendo sustancias químicas que en
presencia de agua liberan H2 y CO2.
Se monitorea el ambiente anaerobio con papel indicador de azul
de metileno o de resarzurina.
INCUBACIÓN DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
Preincubación de los medios en Sistemas de incubación en
anaerobiosis anaerobiosis.
Su elección es determinada por el costo, y
limitaciones de espacio.
Los más comunes son las cámaras, cajas
y bolsas de anaerobiosis.

Bolsas
INCUBACIÓN DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
Preincubación de los medios en
anaerobiosis

Bolsas

Contenedores
INCUBACIÓN DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
Estufas

Jarras
 OBTENCION DE CULTIVOS PUROS
1. Siembra en superficie. Extensión y estría.

2. Vertido en placa. Mezclando los microorganismos con agar

fundido a 44ºC, y se echa luego sobre la placa. Los
microorganismos crecen en la superficie y dentro

3. Técnicas de enriquecimiento. Aplicar el elemento

adecuado (por ejemplo benzoato) al tubo de ensayo, se
aíslan microorganismos que no se aíslan con los métodos
anteriores y que están en pequeñas cantidades (como
pueden ser aquellos que sólo usan benzoato).
4. Dilución seriada. Sólo aíslo el microorganismo más
abundante, se y se hace siembras de estas.
 OBTENCION DE CULTIVOS PUROS
5. Micromanipulador: aislamos una sola célula utilizando
este aparato.

6. Aislamiento de microorganismos anaerobios.

• Obtenemos los organismos anaerobios por una adición
de agar a 44ºC, mezclamos y tapamos con parafina
(aceite estéril).
• Eliminamos el O2 con agentes reductores (tioglicolato,
añadimos un colorante REDOX para ver cuando se ha
reducido), con una vela que consuma el oxígeno,
usamos la jarra de anaerobios (sistema que produce
CO2 + H2 y un catalizador que consume O2).
• Cuanto más sensibles son más precauciones tenemos
que tomar. PARAFINA
CARACTERIZACIÓN DE CULTIVOS PUROS

• Las colonias deben ser iguales en forma, tamaño y

color.
•
No deben existir formas inhibidas.
•
Al microscopio deben tener un aspecto común.
•
Tiene que tener iguales propiedades tintoriales.
•
Deben ser bioquímicamente y fisiológicamente iguales.

Una regla importante es no coger nunca de la primera

colonia.
 CONSERVACION DE CULTIVOS BACTERIANOS
MANTENIMIENTO

1.- Transferir periódicamente, ya que los tubos de agar se

secan, se evapora el agua.

2.- Cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede

hacer más tarde, disminuye el metabolismo y tardan en
envejecer.

3.- Disminuir la temperatura, congelamos las células. Para

proteger las células y para que no se formen cristales que
las dañen se usa el glicerol

4.- La liofilización es la sublimación a alto vacío de las

muestras congeladas con rapidez.
 FORMAS DE CRECIMIENTO. CULTIVOS

Las fermentaciones, pueden clasificarse en: continua,

semicontinua o intermitente.

a.- PROCESO INTERMITENTE. Fermentación Batch.

• Se refiere al crecimiento de células en sistema cerrado.
• Una vez cargada la masa inicial del medio, no hay
adiciones o retiros posteriores de nutrientes hasta el fin
de la fermentación.
• Consecuencia: Varían el pH, temperatura y la
concentración de nutrientes con el tiempo.

Ciclo de crecimiento microbiano.

• El crecimiento no es lineal y sigue un patrón
 CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO

•Fase lag. Adaptación al nuevo ambiente.

•Fase exponencial (log) velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones
particulares.
•Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0.
vc=vm (vel. crecimiento = vel de muerte)
–nutrientes limitantes
–acumulación de desechos, inhibición del crecimiento
•Fase de muerte. velocidad de muerte celular > velocidad de división celular
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL PROCESO BATCH.
•Su mayor ventaja es la sencillez.
•Desventajas: alto requerimiento de mano de obra, y
demasiados tiempos muertos.
•Tiempos muertos: Fase de adaptación, fase de decaimiento,
periodo de descarga, y renovación de la carga del reactor
para un nuevo batch.
 PROCESO SEMICONTINUO
•Se evitan las fases de adaptación y decaimiento.
•Periodicamente se extrae medio agotado y se repone medio fresco.
–mantener la concentración de sustrato suficientemente alta para
evitar escases.
–la concentración del producto suficientemente baja para no
sobrepasar los límites tolerables.
–Se evita la formación de productos secundarios, haciendo las
adiciones de medio nuevo, antes de alcanzar la fase estacionaria,
manteniendo el cultivo en fase exponencial
 PROCESO SEMICONTINUO
•Los parámetros a controlar: volumen y tiempo de adición, se
calculan de modo que el cultivo se mantenga en fase logarítmica.
•Si el volumen extraído es muy grande puede diluirse tanto el
medio, que la masa microbiana puede volver a la fase de
acostumbramiento
•Si el volumen extraído es muy pequeño para igual tiempo el
cultivo puede agotarse y pasar a la fase estacionaria.
•Si el tiempo de renovación es muy grande el cultivo puede
alcanzar a la fase estacionaria y si es muy pequeño el cultivo puede
regresar a la fase de acostumbramiento.
•Una vez alcanzada la concentración X’ de células en la fase
exponencial, se extrae un volumen igual a: V= ( X’ - Xo) d.
•Luego se agrega igual cantidad de medio nuevo, diluyendo el
producto y las células hasta un valor X’o.
 PROCESO EN CULTIVO CONTINUO

• Crecimiento de células en sistema abierto.

• Constantemente se suministra nuevo medio de
cultivo al bioreactor, con agitación constante, y se
retira producto y células.
• Cuando el sistema alcanza estado estable, la
concentración de células, productos y sustrato
permanecen constantes.
• Proporciona condiciones constantes para el
crecimiento celular, y la formación de productos y se
pueden obtener productos de calidad uniforme
 CONTROL POR QUIMIOSTATO
• El reactor opera con dos elementos de control: la
tasa de flujo ó la concentración de un nutriente
limitante tal como la fuente carbonada o
nitrogenada. (quimiostato)
• Los demás nutrientes en el medio se encuentran
en exceso.
• La densidad de la población está controlada por la
concentración del nutriente limitante.
• Cuando el sistema está en equilibrio, el número de
células (densidad de la población) y el estado
nutricional permanecen constantes (estado
estable).
 PARAMETROS CINETICOS DEL
CRECIMIENTO
•Tasa de crecimiento.μ

•Tiempo de duplicación. g. tiempo necesario para duplicar una

biomasa.
•Xo ----g--- 2Xo
•Al tiempo 0 x = xo
•Después de: 1 generación x= 2.xo.
•En 2 generaciones x = 2(2xo.) =22 xo
•En 3 generaciones x = 2(22 xo)= 23xo
•En n generaciones x = 2n xo , Y =2n.Xo

•Para calcular n = (número de generaciones)

•n = t/g
 …

• Aplicando logaritmos: X = 2n Xo
• Log X = log Xo + n log 2

• Sustituyendo log 2 por su valor 0.3010, se tiene que 1/0.3010

= 3.3
• n = 3.3(logX – logXo)
• n = 3.3 log (X/Xo)
• En ln. ( ln2=0.69), y reemplazando n =t/g se tiene:
• g =0.69 t/(lnX-lnXo)
 TIEMPOS DE GENERACIÓN EN BACTERIAS
Bacteria Medio Tiempo de generación
(min)

E. Coli Glucosa-sal 17

Bacillus megaterium Sacarosa-sal 25

Streptococcus lactis Leche 26

Staphylococcus aureum Caldo infusion de corazon 27-30

Streptococcus lactis Caldo lactosa 48

Lactobacillus acidófulus Leche 66-87

Rhizobium japonicum Leche 344-461

Mycobacterium Sintético 792-932

tuberculosis
 EJEMPLO.1
Se tienen 1000 bacterias en un medio de cultivo óptimo y
después de 4 horas de incubación, creciendo
exponencialmente, se obtienen 100 000 bacterias. Calcule
el tiempo de generación.

• Xo = 1000
• X = 100 000
• T = 4 horas
• g =? g = t/n
• n = 3.3 log X/Xo , n = 3.3 log 100000/1000
• n = 6.6 generaciones

• g =T / n
• g = 240/6.6 = 36,36 minutos
 TASA DE CRECIMIENTO

Velocidad específica de crecimiento (μ)

• Es la velocidad de crecimiento de una población

microbiana.
• μ = 1 . dX
. X dt
• Unidades: t-1
• dX/dt, la velocidad instantánea del crecimiento celular.
• valor de μ sólo en fase log, donde μ es máxima.
 DETERMINACIÓN DE μ
•μEs la velocidad específica de crecimiento en un sustrato dado, y
significa la afinidad del microorganismo por el sustrato
•Para un m.o. dado depende de:
–La composición y concentración del medio.
–Presencia de inhibidores
–Temperatura y pH
¿Que indica la Ecuación de Monod?
–Explica la velocidad de crecimiento en función del sustrato limitante

x = concentración de microorganismos g/l

t = tiempo, h
μ = velocidad específica de crecimiento h-1
 PARÁMETROS ESTEQUIOMÉTRICOS
Se puede establecer una relación a través de: balance de materiales,
coeficientes de crecimiento, y coeficiente de mantenimiento.

Balance del consumo de sustrato.

• El sustrato es utilizado por las células como fuente de energía y
como materia prima para la síntesis de macromoléculas
constitutivas.
• Por tanto en un tiempo cualquiera, el consumo de sustrato (ΔS)
es:

S = S asimilado + S convertido + S energía de + S energía

en biomasa en producto crecimiento de mantenim
COEFICIENTE DE RENDIMIENTO BIOMASA-SUSTRATO

Relación entre la variación de la biomasa y la variación del

sustrato
.
• Yx/s= -X/S

• Para organismos aerobios que crecen en glucosa se

tiene que los Yx/s típicos son:
– para levaduras y bacterias varía entre 0.4 y 0.6 g/g,
– en condiciones anaerobias el valor de Yx/s es
substancialmente menor.
• En metano, con bacterias el Yx/s será 0.6 y 1.0 g/g
COEFICIENTE DE RENDIMIENTO BIOMASA-OXÍGENO.

Esta dado por la relación de biomasa producida y el

consumo de O2 del medio.

Yx/O2= -X/O2

•Yx/O2 para bacterias y levaduras aerobias que crecen en

glucosa es de 0.9 a 1.4 g/g
•Un cambio en el sustrato ocasionará variaciones en el
valor del coeficiente
•Los mismos m.o. en las mismas condiciones, pero en
metano tendrán un Yx/O2 de alrededor de 0.2 g/g.
COEFICIENTE DE FORMACIÓN DE PRODUCTO (QR), O YP/S.

Yp/s = - P/S

• Puede variar según el producto y la forma como se

producen.
• Los productos microbianos pueden ser clasificados
en tres categorías: productos asociados al crecimiento,
productos no asociados, y productos asociados mixtos.
• En productos asociados. La formación de producto es
proporcional a la tasa específica de crecimiento (µ). Ej.
La producción de una enzima constitutiva.
• Productos no asociados. Antibióticos
 COEFICIENTES PARA M.O AEROBIOS
Yx/s Yx/o2
Organismo Sustrato
g/g g/mol g/g-C g/g
Enterobacteraerógenes Maltosa 0.46 149.2 1.03 1.50
Manitol 0.52 95.2 1.32 1.18
Fructosa 0.42 76.1 1.05 1.46
Glucosa 0.40 72.7 1.01 1.11
Candida utilis Glucosa 0.51 91.8 1.28 1.32
Penicillium chrysogenum glucosa 0.43 77.4 1.08 1.35
Pseudomonas fluorescens glucosa 0.38 68.4 0.95 0.85
Rhodopseudomonas spheroides glucosa 0.45 81.0 1.12 1.46
Saccharomyces cerevisiae Glucosa 0.50 90.0 1.25 0.97
Enterobacter aerógenes Ribosa 0.35 53.2 0.88 0.98
Succinato 0.25 29.7 0.62 0.62
Glycerol 0.45 41.8 1.16 0.97
Lactato 0.18 16.6 0.46 0.37
Piruvato 0.20 17.9 0.49 0.48
Acetato 0.18 10.5 0.43 0.31
 COEFICIENTES PARA M.O AEROBIOS

Organismo Sustrato Yx/s Yx/o2

g/g g/mol g/g g/mol

Cándida utilis Acetato 0.36 21.0 0.90 0.70

Pseudomonas fluorescens Acetato 0.28 16.8 0.70 0.46

Cándida utilis Etanol 0.68 31.2 1.30 0.61

Pseudomonas fluorescens Etanol 0.49 22.5 0.93 0.42

Klesbiella sp. Metanol 0.38 12.2 1.01 0.56

Metylomonas sp. Metanol 0.48 15.4 1.28 0.53

Pseudomonas sp. Metanol 0.41 13.1 1.09 0.44

Metyloccocus sp. Metano 1.01 16.2 1.34 0.29

Pseudomonas sp. Metano 0.80 12.8 1.06 0.20

Metanol 0.60 9.60 0.80 0.19

Pseudomonas metánica Metano 0.56 9.00 0.75 0.17

 MODELOS CINETICOS
Modelos no estructurados. Son modelos aproximados.
Modelo de Monod,
Modelo de Contois,
Modelo de Mosser,

Modelos estructurados. Tienen mayor capacidad

predictiva y para ello tienen en cuenta las interacciones
cinéticas entre los componentes celulares y los
componentes del medio.
 MODELO DE MONOD

S = Concentración del sustrato limitante

μm= μ máxima (en fase exponencial)
Ks= Constante de saturación. Relación inversa con afinidad del m.o por el
sustrato.
Cuando S > > Ks, μ toma el valor de μm y rx sólo depende de x.
En general Ks tiene valores muy bajos, del orden de los mg/l.
En promedio:
En bacterias μm ……………………………… 0.9 h-1
Las levaduras…………………………………… 0.45 h-1
Los hongos filamentosos………………… 0.25 h-1
LINEARIZACIÒN DEL MODELO
 MODELO DE CONTOIS

Muestra una dependencia de la tasa específica de la reacción

con respecto a la concentración de organismos activos
presentes.

 m S 

K sx x  [S ]
Ejemplo
Una cultivo de microorganismos BATCH en crecimiento, en
sustrato de glucosa, dio los siguientes datos.

TIEMPO CONC. CELULAS (X) ln X CONC. GLUCOSA

(h) (g/l) (g/l)

0 1.25 0.2231 100.00

9 2.45 0.8961 97.00

16 5.10 1.6292 90.40

23 10.50 2.3514 76.90

30 22.00 3.0910 48.10

34 33.00 3.4965 20.60

36 37.50 3.6243 9.38

40 41.00 3.7136 0.63

• a) Calcular la velocidad máxima de crecimiento.
• b) Calcular la variación de sustrato
• c) Cuál es la concentración celular máxima que podría esperarse si
150g de glucosa fueron usados con la misma cantidad de inoculo.

Rpta. a)

ln X

 ln X

t t (h)
 y  ln X ln 37.5  ln 5.1
tg  m   m   0.1 h 1
x t 36  16
b) Rpta.
Calcular la variación de sustrato por el crecimiento celular.

X celuar Rango de Conc. Celular

y 
S sustrato Rango de Conc. Sustrato

41  1.25
y  0.40 gr de células / gr de sustrato
0.63  100

c) Rpta.
X max  X 0  Y .S 0
X max  1.25  0.4(150)
g células
X max  60.25
lt
 MODELO LOGISTICO

• Los modelos anteriores representan el comportamiento de

los m.o. sólo en la fase log de un cultivo batch (donde  es
constante)
• Si se quiere representar todo el proceso, es necesario
recurrir al modelo logístico.
• Este modelo es capaz de arrojar una curva sigmoidal
• Se obtiene combinando la ecuación de Monod con la
expresión de μ y la de rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s).

dX = m(Yx/s.So + Xo – X) . X
dt (Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)22
 MODELOS ESTRUCTURADOS.

• Al construir el modelo se debe decidir cuantos componentes

celulares se tomaran en cuenta. ( de 2 a 40)
• Un resultado aceptable se produce usando al menos 3
componentes celulares.
• Con mas componentes el modelo será mas preciso, pero
también mas complejo.
• Estos modelos consideran: las concentraciones intrínsecas,
(cantidad de un componente por unidad de masa celular)
(Ci/X), y las concentraciones extrínsecas o cantidad de un
componente por unidad de volumen del reactor.

d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt)

dt X.dt X. X

• Ci, es la concentración de cada componente.

• Con más de un substrato limitante se pueden usar modelos
multiplicativos, modelos aditivos y modelos nominativos
• Son desarrollados con amplitud en el libro de Shuler-Kargi.
• El modelo aditivo toma la forma:

•  = W1.S1 + W2.S2 + ... + Wn. Sn

max

• donde W1, W2, ..., Wn son funciones del peso, y  sigue la

cinética Monod.
MEDICION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
TECNICAS DE MEDICION

Se pueden agrupar en dos:métodos directos y los

métodos indirectos.
Directos obtienen una medida de la masa celular
por:
• Técnicas de conteo,
• Medida de concentración de masa celular:
peso celular, absorbancia.
Indirectos miden la concentración de algún
componente celular (ADN, proteínas, etc).
 ABSORCIÓN DE LUZ.
• Se aprovecha la particularidad de las células para desviar la
luz.
• Usar, turbidímetro o espectrofotómetro 600- 700 nm.
• Las células se comportan como simples partículas en
suspensión.
• El efecto sobre el haz incidente de luz será proporcional a la
concentración de células presentes segun la ley de Beer.
• Calibrar para cada m.o.
• Valores altos de OD (mayores a 0.3) afectarán la linealidad en
la respuesta.
• Este método es apropiado para medios libres de partículas en
suspensión.
 MEDIDAS INDIRECTAS DEL CRECIMIENTO
BACTERIANO

• Turbidez. Es un método muy rápido y útil de medir el

crecimiento bacteriano.
- fotómetro -
- espectrofotómetro -
 CÁMARAS DE RECUENTO
•Son placas de vidrio. En el centro hay cuatro ranuras longitudinales.
•La superficie del puente central es más profunda que los puentes
exteriores. Allí están grabadas las redes de conteo.
•Al colocar el cubreobjetos sobre los puentes exteriores, entre su cara
inferior y el puente central de la cámara de conteo se produce una ranura
capilar

Identificación.
• En las dos superficies laterales, sin trabajar, de la cámara de conteo
están impresas las siguientes indicaciones: El sistema de la red de
conteo, El nombre y la marca registrada del fabricante, La
profundidad de la cámara en milímetros , La superficie del cuadrado
más pequeño en mm2
•Cuadrado de 3 x 3 mm, con separación
entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. CÁMARA DE
•El área sombreada y marcada L es 1 mm2. NEUBAUER
•La depresión central está hundida 0.1 mm
respecto a la superficie.
•El volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
mm3 (0.1 microlitro)
•Los cuadrados L están subdivididos en 16
cuadraditos de 0,0025 mm2 cada uno.
•El cuadrado del centro está dividido en 5
cuadrados por lado con una longitud lateral
de 0,2 mm, y superficie de 0,04 mm2.

•Si contamos las cuatro áreas sombreada

(L) observando un total de x células entre
las cuatro áreas, la concentración en la
suspensión celular será :
•células / mL = 10000 (x/4)
 TÉCNICA DE CONTEO
•Para que las células, no se cuenten
dos veces, reglas:
Se cuentan las células dentro de la
zona definida.
También se cuentan las células, que
se apoyan o tocan en dos caras ,
p.ej. en la línea de medida izquierda
y superior.
•Efectuar conteo en forma de
meandro
 OBSERVACIONES SOBRE EL RECUENTO

a) En los conteos de cámaras, el diafragma del

condensador en el microscopio deberá estar cerrado en
gran parte.
b) La diferencia de las células contadas en los cuadrados
grandes y en los cuadrados de grupos no podrá ser
superior a 10 células.
c) El valor medio de los conteos se aplica luego en una
fórmula de cálculo o se multiplica por el factor
correspondiente.
 B) EQUIPOS AUTOMÁTICOS
"Cell Coulter" de Beckman-Coulter
•El principio se basa en la medida de
los cambios en la resistencia eléctrica
que se producen cuando una partícula
no conductora en suspensión en un
electrolito atraviesa un pequeño
orificio.
•Es posible contar y medir varios miles
de partículas por segundo,
independientemente de su forma,
color y densidad.
 CONTEO EN PLACAS.
• Se asume que cada colonia proviene de la división sucesiva de
una sola célula, conociendo el volumen sembrado y la dilución de
la cual proviene y contando el número de colonias en la placa
correspondiente se puede calcular el número de células viables
en la muestra
• Debido a que es difícil saber si una sola bacteria dio origen a una
colonia, se expresa usualmente el número de células viables
como unidades formadoras de colonias (UFC).
• Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que
contengan entre 25 y 250 colonias.
• A pesar de las deficiencias que pueda presentar la técnica del
recuento en placas, se usa frecuentemente, y con resultados
satisfactorios, para la estimación de las poblaciones bacterianas
en la leche, agua, y otros productos.
• Es fácil de realizar y se adapta a la medición de poblaciones de
cualquier densidad.
Placas petrifilm (3M)
DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES
POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la

fase confirmativa.

• En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza

es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la
recuperación de los microorganismos dañados que se
encuentren presentes en la muestra y que sean
capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono.
• Durante la fase confirmativa se emplea como medio de
cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es
selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos
microorganismos capaces de tolerar tanto las sales
biliares como el verde brillante.
 DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS COLIFORMES
TOTALES POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

Para su estudio, se dividen en dos grupos.

• El grupo de bacterias coliformes totales el cual
comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la
lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h.
a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros
principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y
Klebsiella.
• El grupo de coliformes fecales, está constituido por
bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa
con producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ±
0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin
embargo la más prominente es Escherichia coli.
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede
realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y
sólidos con características selectivas y diferenciales.
 Número mas probable (NMP)

10 mL de inóculo
6 tubos positivos
(com crescimento
bacteriano)

1 mL de inóculo 3 tubos positivos

1 tubos positivos
0,1 mL de inóculo
 D. PESO SECO.

•Secar volúmenes conocidos de medio con las células en

crecimiento, hasta obtener un peso constante.
•Para levadura se puede usar una centrífuga con velocidades de
4-6x103rpm. Se obtiene una masa húmeda de células, luego
esta masa se lava y seca a 80ºC por 24 horas, y pesar.
•En células bacterianas, se usan filtros de membranas para
obtener la masa celular húmeda, y luego se seca
•Puede ser usada cuando el medio no contiene sólidos en
suspensión.
•Requiere muestras muy grandes y son lentos.
 MASA DE UN COMPONENTE CELULAR.

• Medida de algún componente celular que sea parte constante

del peso seco total de las células.
• Pueden ser: proteínas, nitrógeno, ADN, RNA, y ATP celulares,
los cuales están presentes en cantidades mas o menos
constantes por especie.
 EFECTOS FÍSICOS.

• Se puede medir la variación de algún factor externo por

efecto del crecimiento celular, tales como; el calor generado
por el crecimiento, o el oxígeno captado por el medio, y que
deja un vacío medible.