ANALISIS PANGAN

DAN HASIL PERTANIAN

TPS.08.4.26P

KROMATOGRAFI, AAS
(7-AP-2015)

Bambang Kun
 KROMATOGRAFI
• Metode pemisahan kimia yang didasarkan
pada adanya perbedaan partisi zat pada fasa
diam (stationary phase) dan fasa gerak
(mobile phase).
 TUJUAN
 KROMATOGRAFI PREPARATIF :
memisahkan senyawa dalam campuran
(biasanya digunakan untuk pemurnian).

 KROMATOGRAFI ANALITIK :
mengetahui perbandingan senyawa dalam
campuran
 ISTILAH DALAM KROMATOGRAFI
 ANALIT  zat yang dipisahkan.

 KROMATOGRAM  output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.

Adanya puncak Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan
analit.

 FASA GERAK  fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.

 FASA DIAM  fasa yang tetap pada tempatnya.

 WAKTU RETENSI  waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistema

yang berbeda.

 VOLUME RETENSI  volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk

mengelusi komponen analit.
 DASAR TEORI KROMATOGRAFI
• Distribusi analit antara dua fasa dapat dijelaskan secara
sederhana. Pada dasarnya, analit berada dalam kesetimbangan
dalam fasa gerak dan fasa diam.
• Amobile ⇌ Astationary

• Koefisien partisi (K) adalah konsentrasi molar analit pada fasa

diam dibagi dengan konsentrasi molar analit pada fasa gerak.
•
Waktu antara injeksi sampel hingga akhir proses
dinamakan waktu retensi (tR). Masing-masing analit dalam
sampel akan mempunyai waktu retensi yang berbeda.
Waktu yang diukur dari fase gerak melewati kolom ( tM ).
Faktor retensi (k') sering digunakan untuk mengetahui laju
migrasi analit pada kolom. Faktor retensi analit ditentukan
dengan rumus:

k'A A = [tR- tM ]/ tM
 KROMATOGRAFI KOLOM
• salah satu metode yang digunakan untuk
pemurnian senyawa dari campuran dengan
memakai kolom. Kromatografi kolom
termasuk kromatografi preparatif.

• Peralatan Kromatografi Kolom

• tabung dengan diameter 5-50 mm dan tinggi
5 cm - 1 m.
• Pada bagian dasar tabung diberi glass wool
 KROMATOGRAFI KOLOM
• Fasa gerak
• Fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Eluen
dipilih sedemikian rupa sehingga faktor retensi senyawa
berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisasi penggunaan
waktu dan jumlah eluen melewati kolom. Jenis eluen yang
digunakan pada kromatografi kolom dipilih supaya senyawa
yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif.

• Fasa diam
• Fasa diam yang digunakan adalah suatu adsorben padat.
Biasanya berupa silika gel atau alumina. Dahulu juga sering
digunakan bubuk selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk
microporous untuk meningkatkan luas permukaan.
 METODE KROMATOGRAFI KOLOM

• METODE KERING
• Kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan
penambahan fasa gerak yang disiramkan pada kolom
sampai benar-benar basah.

• METODE BASAH
Bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada
serbuk fasa diam dan dimasukkan secara hati-hati pada
kolom. Dalam langkah ini harus benar-benar hati-hati
supaya tidak ada gelembung udara. Larutan senyawa
organik dipipet di bagian atas fasa diam, kemudian eluen
dituangkan pelan-pelan melewati kolom.
•
CARA KERJA KROMATOGRAFI KOLOM

• Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena

telah terikat
• Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi,
terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran.
• Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan
yang berbeda-beda dalam melewati kolom.
• Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi.
Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang
berbeda.
• Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati
menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan
mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut
menggunakan spektroskopi.
KROMATOGRAFI KOLOM
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

• Fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan

adsorben inert.
• KLT merupakan salah satu jenis kromatografi
analitik.
• KLT sering digunakan untuk identifikasi awal,
karena banyak keuntungan menggunakan KLT,
di antaranya adalah sederhana dan murah.
 PERALATAN KLT

 Plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti

silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun
selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai
fasa diam.
 Fasa gerak (eluen) didasarkan pada polaritas
senyawa dan biasanya merupakan campuran
beberapa cairan yang berbeda polaritas,
sehingga didapatkan perbandingan tertentu.
Eluen KLT dipilih dengan cara trial and
error.Kepolaran eluen sangat berpengaruh
terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh.
 FAKTOR RETENSI

 Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak
yang ditempuh oleh eluen.

 Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen

tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi
adanya perbedaan senyawa dalam sampel.
 Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai
kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut
dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar
akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf
yang rendah.
Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi,
yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan
sebaliknya.
 Potong plat selebar 1 cm. Berarti jika menguji 3 sampel (3 spot) berarti
menggunakan plat selebar 3 cm.
 Buat garis dasar (base line) di bagian bawah, sekitar 0,5 cm dari ujung
bawah plat, dan garis akhir di bagian atas.
 Menggunakan pipa kapiler, totolkan sampel cairan yang telah disiapkan
sejajar, tepat di atas base line. Jika sampel padat, larutkan pada pelarut
tertentu. Keringkan totolan.
 Dengan pipet yang berbeda, masukkan masing-masing eluen ke dalam
chamber dan campurkan.
 Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line jangan sampai
tercelup oleh ulen. Tutuplah chamber.
 Tunggu eluen mengelusi sampel sampai mencapai garis akhir, di sana
pemisahan akan terlihat.
 Setelah mencapai garis akhir, angkat plat dengan pinset, keringkan dan ukur
jarak spot. Jika spot tidak kelihatan, amati pada lampu UV. Jika masih tak
terlihat, semprot dengan pewarna tertentu seperti kalium kromat atau
ninhidrin
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
KROMATOGRAFI GAS
 KROMATOGRAFI GAS

 Fase gerak  gas dan zat terlarut terpisah

sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan
partisi sampel antara fase gas bergerak
 Fase diam  cairan dengan titik didih tinggi
(tidak mudah menguap) yang terikat pada
zat padat penunjangnya.
KROMATOGRAFI GAS
GC-MS
GC-MS
HPLC
ICP
SPEKTROFOTOMETER
AAS
AAS