Ilmu Kedokteran Forensik Molekuler

dr.Taufik Hidayat, M.Sc, Sp.F

Bagian Ilmu Kedokteran Forensik dan Medikolegal

Fakultas Kedokteran
Universitas Andalas
2017
 Pendahuluan
• Forensik Molekuler=DNA Forensik=Biologi Molekuler
Forensik=Genetika Forensik
• DNA profilling=DNA fingerprinting=DNA typing
• Pemanfaatan teknologi DNA dalam bidang kedokteran
forensik merupakan kemajuan terbesar dalam proses
identifikasi.
• Profil DNA unik untuk setiap individu kecuali pada
kembar monozigot.
• Peluang profil DNA dua individu sama adalah sekitar 1
dalam 30 milyar-300 milyar.
 Sejarah

• Alec Jeffreys (Leicester University) dikenal

sebagai father of DNA fingerprinting.
• Dia menemukan varians dalam sampel DNA
manusia. Pada tahun 1984 dia menemukan
bahwa dengan bantuan enzim restriksi, DNA bisa
dipotong-potong dan didapatkan band DNA yang
mirip bar-code.
• Penemuannya ini memajukan secara cepat
bidang forensik.
 Makhluk hidup tersusun dari sel, yang
dapat membelah dan menurunkan informasi
genetiknya
 Dibawa oleh DNA : rantai polimer panjang
yang merupakan rangkaian dari jutaan
nukleotida
 Rangkaian DNA disebut kromosom, setiap
kromosom dibagi menjadi lokus-lokus yang
menandai posisi gen dalam kromosom.
Gen-gen yang terdapat pada lokus-lokus ini
dinamakan alel.
 Gen pada satu lokus=lokus pd kromosom
pasangannyaalel homozigot, jika
berbedaalel heterozigot
 Fragmen DNA yang mengkode protein,
suatu unit keturunan  Gen; mengandung
makna 1 kodon (3 nukleotida:AA tertentu)
 Gen tdd: promotor (tempat regulasi gen)-
ekson (bagian yang punya arti dalam
membentuk protein)-intron (bagian yang
tidak ada arti)
 Total informasi genetik yang tersimpan
dalam kromosom  genom
Struktur DNA
•Gula deoksiribosa
•Ikatan kovalen fosfodiester
•Pasangan basa nukleotida purin
(AG), pirimidin (TC)
•ikatan hidrogen
DNA forensik:
a. DNA inti/nuclear DNA/core DNA
b. DNA mitokondria

DNA inti:
1.Coding region: berisi informasi genetik, relatif
tetap, tidak bemanfaat untuk identifikasi
2. Noncoding region: polimorfis/sangat variatif.
Dapat berada dalam rangkaian gen dan diluar
gen. Noncoding yang mengelompok dan
terletak dekat coding disebut satelit yang berisi
urutan molekul DNA berulang-ulang (tandem
repeats)

DNA (coding&noncoding) berbeda antar

individu karena mutasi

Mutasi terjadi karena faktor

lingkungan&kesalahan saat replikasi

Mutasi: substitusi, delesi, insersi

Mutasi pada coding regionperubahan

rangkaian AAtanpa penyakit,penyakit,letal

Mutasi pada noncoding regiontidak ada

pengaruh

Mutasi 1 nukleotida, tidak penyakit&dimiliki

banyak orangsingle nucleotide polymorphism
(SNP)
 Polimorfisme nDNA
 Short Tandem Repeats (STR)rangkaian 2-6bp yang berulang beberapa kali pada
daerah 200-1000bp
 Pada STR urutan DNA yang berulang-ulang biasanya tetranukleotida (ATGC-ATGC-
ATGC)
 STR terdapat pada kromosom autosom dan seks
 Terdapat banyak lokus STR pada genom manusia, namun baru beberapa yang diteliti
untuk kepentingan forensik
 Sebagian lokus STR diberi nama berdasarkan nomor kromosomnya contohnya
D16S539, berarti STR tersebut terletak pada kromosom 16.
 Laju mutasi nDNA lebih lambat dari mtDNA karena nDNA dilindungi histon sehingga
tahan terhadap mutasi
 Mutasi pada STR unik karena terjadi dalam kelompok pengulangan, misalnya lokus
STR D16S539, urutan DNA yang berulang adalah GATA. Jika seseorang memiliki
pengulangan 9 kali pada lokus tsb maka ditulis sebagai alel 9. Pada generasi
berikutnya dapat terjadi mutasi, misalnya terjadi delesi dua nukleotida pada ujung
rangkaian (GATA)9,sehingga berubah jadi alel 8.2
 Variasi jumlah pengulangan inilah dasar identifikasi berbasis STR
• Sesuai pola pewarisan nDNA, hanya satu alel dari lokus STR yang
akan diturunkan pada keturunan
• Jika anak memperoleh nomor alel yang sama baik dari ayah maupun
ibu, maka profilnya adalah homozigot
• Pasangan kromosom yang diperoleh satu anak dapat berbeda
dengan pasangan kromosom anak lainnya dari pasangan orang tua
yang samavariasi nDNA antar saudara kandung, namun selalu
ada alel yang sama yang dimiliki orang berkerabatkerabat sebagai
pembanding jika diperlukan
• Variasi nDNA dapat mengelompok dalam populasi karena
kecendrungan manusia kawin dalam populasi yang sama
• Ada pula fenomena varian STR yang hanya dan banyak dimiliki etnis
tertentu
 Pewarisan DNA inti
A. Pola pewarisan DNA intiMendellian50% ayah+50%ibu
• Manusia: Kromosom somatik22 pasang autosom+XX atau XY
• Pada sel gamet (sperma dan ovum) ada kromosom seks22
autosom + X atau Y
• Maka seorang anak mendapat 22 kromosom somatik/autosom+
kromosom X atau Y dari sperma ayah dan 22 kromosom
somatik/autosom+ 1 kromosom X dari ovum ibu22 pasang
kromosom autosom+ 1 pasang kromosom seks XX atau XY
B. Pola pewarisan Y-DNApaternal lineage
 Pemeriksaan nDNA
1. Pengumpulan dan pengawetan sampel
2. Isolasi/ekstraksi DNA
3. Pengukuran kadar dan kemurnian DNA
4. Amplifikasi PCR
5. Elektroforesis
6. Jika genotyping konvensional: RFLP (pemotongan
dengan enzim restriksi)analisis datakesimpulan
7. Jika pemeriksaan STR digunakan elektroforesis kapiler
otomatiselektroforegramanalisis datakesimpulan
 1. Pengumpulan dan pengawetan sampel

• DNA ada pada semua sel tubuh

• Sumber nDNA: Darah (whole blood), Otot, Tulang,
Gigi, Rambut (folikel), Urine (sel-sel yang terikut dalam
filtrasi ginjal), sperma dsb.
• Bisa pada pakaian yang dipakai lama dan didaerah
yang basah (mis: aksila)keringat, epitel
• Bibir gelas yang dipakai untuk minumsaliva, epitel
• Jaga sampel dari kerusakan/degradasi DNA
• Hindari kontaminasiantar 2 individu
• Pengawetan dan penyimpanan sampel misalnya
dengan formalin, nitrogen,parraffin blockuntuk
jaringan, kalau darah dengan EDTAkulkas.
Bercak darahsilika gelkering supaya tidak
berjamur
• Labelharus
 2. Ekstraksi DNA
• Bisa secara konvensional (fenolkloroform) dan Kit (lebih mudah)
contoh: Wizard® Genomic DNA Putrification Kit
• Melisiskan sellysis buffer, kalau sampel padat gerus dulu. Tulang
didekalsifikasi dulu dengan merendam dalam larutan tertentu.
Rambut didekeratinisasi duludipukul-pukul dulu.
• Melisiskan nukleus
• Lalu hilangkan proteinnya. Lysis buffer+proteinasediamkan
semalam lalu kasih fenolkloroformsentrifuge.
• Simpan dikulkas suhu 4 c agar tidak rusak.
 3. Menilai kadar dan kemurnian DNA
• Menilai hasil ekstraksi DNAspektrofotometer
(murah, ada blankocahaya dengan panjang
gelombang tertentu).
• Bisa juga dengan elektroforesis.
• Hasil ekstraksi DNA; jumlah DNA (100ng/ul baru
bisa di PCR)
• Purity of DNA templatehindarkan kontaminasi
DNA lain (peneliti memakai APD)
 4. AMPLIFIKASI PCR

• PCRfragment DNA yang akan dianalisis

direplikasi secara invivomemeriksa 1 gen
sangat sulitPCR dengan membuat tiruan.
• Mesin PCRalat thermocycle, suhu berubah
otomatis
• PCR tidak boleh: untuk diagnosis penyakit infeksi,
mutasipositive palsu
Komponen reaksi PCR/proses PCR
• DNA templatebahan yang akan dianalisis
• 1 pasang primer
• dNTPmixbahan baku sintesis nukleotida
• PCR buffer
• DNA polimerasepemanjangan DNA
• Airpenyesuaian volume
Langkah-langkah PCR
1. Denaturasi
• Ikatan hidrogen rusak,semuanya bisa lepasdouble strandssingle
strands
• Misalnya suhu 94 C selama 4 menit
2. Annealingpenempelan primer
• Primergene bank DNA pada gen yang akan diteliti. Setiap PCR
primernya sepasang (primer F dan R)
• Prinsip merancang primerpasangan komplementer akan
menempel,contohnya merancang primer P30masukkan keyword P30
gene pada programkeluar urutan basanyayang dipesan kepabrik
pasangan/komplementernya.
• Suhu Annealing 3-5 C dibawah suhu meltingsuhu melting: 4x
(#G+#C)+2 (#A+#T)
• Misalnya suhu 55 C selama 1 menit
3. Elongasi
• Bertambah panjang
• Diakhir proses didapatkan lagi dua pita berpilin
• Perlu DNA polimerase
• Misalnya suhu 72 C selama 1 menit
Siklus akan berulang-ulangNormal 32 siklus
5. Elektroforesis
• Elektroforesismemisahkan DNA berdasarkan panjang molekul,
butuh waktu 20-30 menit,butuh pewarnaan dengan ethidium
bromide+UV. Ladder dirancang dipabrik, nilainya sudah diketahui.
• Hasil tidak ada pitatidak ada DNA. Pita lebih pendeksuhu
PCR rendah. Pita lebih panjangmutasi insersi.
• Proses elektroforesis:
1.Agarose
2. Tae Buffer
3. Panaskan sampai agarose larut
4. Cetak
5. Sampel hasil PCR dicampur dengan loading buffer
6. Tetesi sampel hasil PCR pada kotak-kotak agarose
7. Campur dengan ethadium bromide
Contoh
6. Genotyping RFLP
• Proses RFLP (Restriction Fragmen Length
Polymorphism) menggunakan enzim restriksi/Enzim
gunting DNA
• Enzim ini berguna untuk rekayasa genetika dan
konfirmasi apakah ada mutasi.
• Membaca pada sisi yang spesifik
• Contoh:
1. Alu1 : memotong DNA urutan AGCT dengan suhu yang
pas
2. HaeIII : GGCC
3. BamHI : GGATCCmemotong seperti L
4. HindIII : AAGCTT
5. Ecori : GAATTC
• Enzim-enzim diatas bisa untuk konfirmasi PCR product
• Contoh: Alu1 memotong AGCT pada bp
99,100,101,102pada elektroforesis 180bpterbagi
2100bp dan 80bp
• Selain memotong, enzim ini juga bisa untuk ligasi, ex:
BamHI
Contoh
 7. Pemeriksaan STR

• Jumlah lokus STR yang digunakan untuk identifikasi

nDNA senantiasa berkembang.
•Salah satunya Combined DNA Index System (CODIS)
yang merupakan database elektronik profil DNA di AS
yang terdiri dari 13 lokus STR
•Sampel DNA diambil dari kasus kriminal, kemudian
dilakukan pemeriksaan profil DNA dan hasilnya
diserahkan ke CODIS. Ketika aksi kriminal terjadi, profil
DNA diserahkan ke CODIS untuk proses identifikasi.
•Pemeriksaan CODIS STR diterapkan dibanyak negara
termasuk Indonesia (walaupun database DNA di
Indonesia belum ada)
• Lokus STR yang dipakai dalam pemeriksaan
harus yang spesifik
• Penelitian tentang parameter forensik/nilai
efisiensi forensik sebuah lokus STR dalam satu
populasi/etnis menjadi penting
• Parameter tersebut meliputi: frekuensi alel,
power of discrimination, heterozigositas, Hardy-
Weinberg Equilibrium, match probability
 LOKUS STR YANG TERMASUK 13 CODIS

 CSF1PO: pengulangan tetranukleotida (AGAT) pada intron ke-6 dari c-fms proto-
oncogen reseptor CSF-1 pada lengan panjang kromosom 5
 FGA: pengulangan CTTT pada intron ke-3 dari lokus human alpha fibrinogen
pada lengan panjang kromosom 4
 TH01: pengulangan TCAT/AATG pada intron ke-1 gen tyrosine hydroxylase pada
lengan pendek kromosom 11
 TPOX: pengulangan AATG pada intron ke-10 dari gen human thyroid peroxydase
pada lengan pendek kromosom 2
 VWA: pengulangan TCTA/TCTG pada intron ke-40 dari gen faktor Von
Willebrand pada lengan pendek kromosom 12
 D13S317: pengulangan TATC pada lengan panjang kromosom 13
 D16S539: pengulangan GATA pada lengan panjang kromosom 16
 D18S51: pengulangan AGAA pada lengan panjang kromosom 18
 D21S11: pengulangan TCTA&TCTG pada lengan panjang kromosom 21
 D3S1358: pengulangan AGAT&AGAC pada lengan pendek kromosom 3
 D5S818: pengulangan AGAT pada lengan panjang kromosom 5
 D7S820: pengulangan GATA pada lengan panjang kromosom 7
 D8S1179: pengulangan TCTA&TCTG pada kromosom 8
 Contoh hasil pemeriksaan 4 loki STR-DNA (elektroforegram) pada kasus ragu ayah

AnalisisLikelihood ratio dan Probability of identity atau pada kasus ragu

ayah menjadi probability of paternity bisa manual atau dengan software.
Hasil yang memuaskan jika diperiksa 9-15 lokus STR DNA
• Teknik analisis hasil pemeriksaan STR DNA
1. Eksklusiseseorang dapat disingkirkan, jika terdapat
beda dua atau lebih lokus STR yang diperiksa (derajat
keyakinan 100%)tidak perlu analisis statistik
2. Inklusiseseorang tidak dapat disingkirkan dari
kemungkinan sebagai orang yang dicari, terjadi jika
match pada semua lokus STR yang diperiksaperlu
analisis statistik genetika populasi dengan faktor koreksi
berupa frekuensi alel masing-masing lokus STR yang
diperiksalikelihood ratioprobability of identity.
Probability of identity inklusi: 99,99%
3. Inkonklusi: Misalnya hanya beda pada 1 alel lokus
STRtambah marker yang diperiksa
• Pernyataan kesimpulan:
1. Eksklusi: Tn A terbukti bukan orang yang menjadi
sumber spesimen
2. Inklusi: Tn A tidak dapat disingkirkan dari kemungkinan
sebagai orang yang menjad sumber spesimen.
Walaupun kurang memuaskan penegak hukum/awam
namun kita tidak boleh melampaui pengetahuan yang
hanya dibuat berdasarkan estimasi statistik, maka
gunakan frasa khusus “kesimpulan tsb tidak terbantah
secara ilmiah/beyond reasonable doubt.
3. Inkonklusifjangan memaksa untuk mengambil
kesimpulan
Ingat filosofi forensik: Lebih baik membebaskan orang yang bersalah karena tidak cukup bukti, daripada
menghukum orang yang belum tentu bersalah.
Pemanfaatan nDNA profilling dalam bidang Forensik

1. Untuk menegakkan identitas seseorang pada kasus: kejahatan

seksual (perkosaan/sodomi/oral seks), kriminalitas (pembunuhan),
kecelakaan/bencana massal, orang hilang, perang, bayi yang tertukar,
amnesia/orang cacat dan kesalahan identitas
2. Untuk membebaskan orang tak bersalah
3. Identifikasi postmortem: kecelakaan, bencana, pembusukan, tubuh
termutilasi, kerangka, ekshumasi, jaringan yang terawetkan.
4. Pemecahan kasus ragu ayah, ragu ibu, ragu kekerabatan lainnya.
5. Untuk menyelesaikan kasus perzinahan, incest, anak hasil
perkosaan, peradilan anak hasil hubungan diluar nikah, kesalahan
penetapan ayah seorang anak.
6. Menyelesaikan kasus pemerasan
7. Menyelesaikan kasus keimigrasian
8. Penentuan identitas anak kembar
9. Identifikasi jenis kelamin.
 1. Disputed paternity

A. hasil elektroforesis

C M F1 F2F3
8
7
6
5
4
3
2
B. DNA profilling using single locus probes
C. ELEKTROFOREGRAM
 2. Matching BB dengan tersangka (hasil elektroforesis)

E 1 2 3

8
7
E=2
6
5
4
3
2
 3. Tubuh termutilasi

L1 L2 L3 A1 A2 B1

8
7
6
5
4
3
2

1: L1.L2,A2 2: L3,A1,B2
 Y-DNA
• Pada manusia panjang kromosom Y sekitar 60 Mb (jutaan pasang
basa) namun hanya memiliki 78 gen.
• Gen SRY (sex-determining regio Y) berada pada kromosom Y yang
mengkode protein yang memicu perkembangan testis dan melalui
rangkaian hormon yang panjang akan memberi jenis kelamin laki-laki
kepada janin.
• Dengan pengecualian dua regio PAR (pseudoautosomal region),
yang berlokasi diujung kromosom, tidak ada rekombinansi yang
terjadi selama meiosis.
• Sekitar 95% kromosom Y bersifat non-recombining, spesifik untuk
laki-laki dan diwariskan tak berubah dari ayah kepada anak laki-laki,
kecuali ada mutasi.
• Kromosom Y mengandung sejumlah besar polimorfisme termasuk
variable number and short tandem repeats (VNTRs dan STRs),
insersi, delesi and single nucleotide polymorphisms (SNPs).
 Pemanfaatan polimorfisme kromosom Y dalam bidang forensik

1. Y kromosom hanya ditemukan pada laki-laki sehingga merupakan

salah satu alat identifikasi berharga khususnya dalam menganalisis
sampel yang bercampur antara laki-laki dan perempuan pada kasus
kekerasan seksual jika ekstraksi DNA yang berbeda tidak
memungkinkan.
2. Y kromosom juga bermanfaat untuk memecahkan kasus ragu ayah
khususnya ketika terduga ayah tidak tersedia.
• Pada beberapa kebudayaan nama keluarga diturunkan melalui jalur
anak laki-laki, begitu jugalah profil Y kromosom
• Pada kasus ini, setiap laki-laki yang bersaudara dari pihak ayah
dapat dijadikan referensi.
• Contoh kasus terkenal yang dipecahkan dg Y kromosom adalah
analisis keayahan dari anak budak presiden Thomas Jefferson
(presiden AS ke-3)
 DNA mitokondria
3 alasan pemanfaatan mtDNA untuk identifikasi:

1. Variasi tinggilaju mutasi tinggi. Alasan karena struktur

tidak terlindung histon dan metabolisme energi sangat aktif
dan mekanisme repair mtDNA tidak berkembang
2. Diwariskan hanya dari garis ibuTidak dapat
membedakan individu dari garis maternal yang sama.
3. Sebuah sel mengandung ribuan mitokondriaisolasi
mtDNA mudah dilakukan pada bahan yang memiliki sedikit
sel (saliva), sel yang tidak berinti (epitel kulit, batang
rambut, kuku, eritrosit) atau yang sudah mengalami
degradasi
• mtDNA manusia mengandung :16,569 base pairs DNA dan
terorganisasi secara sirkular tertutup.
• mtDNAmolekul polimer rantai ganda, satu kaya guanin (heavy
strand), satu kaya sitosin (light strand)
• mtDNA memiliki kode genetik berbeda dengan nDNA
• Daerah noncoding pada mtDNA: D-loop yang disebut juga control
region
• D-loop tdd: Hypervariabel Segment I (HVS I) dan HVS II
• Jika populasi mtDNA dalam satu sel identik: homoplasmy
• Pewarisan mtDNA hanya melalui garis keturunan ibusaat
pembuahan mtDNA ayah tidak masuk kedalam ovum karena terletak
didaerah leher/ekor sperma (yang masuk kedalam ovum adalah bagian
kepala sperma). Pendapat lain, mtDNA ayah dapat masuk ke dalam
ovum, namun kalah jumlah. mtDNA sperma 100-1500,sementara
mtDNA ovum 100.000
 Analisis mtDNA
• Pengumpulan dan pengambilan
sampel
• Ekstraksi DNA
• Amplifikasi PCR
• SequencingVariasi Sekuens
 Pemanfaatan mtDNA profilling dalam bidang Forensik

1. Tingginya jumlah copy mtDNA membuat mtDNA dapat dianalisis

walaupun jumlah sampel sangat sedikit. Materi dari TKP biasanya
dilakukan analisis mtDNA termasuk batang rambut dan sampel feses.
2. mtDNA pada sampel manusia yang telah terdegradasi berat dan tidak
mungkin lagi untuk dilakukan analisis STR-DNA.
3. Pola pewarisan maternal mtDNA bermanfaat untuk identifikasi
kekerabatan ketika sampel dari keluarga inti tidak bisa didapatkan
sebagai referensi, contoh kasus nya adalah identifikasi beberapa
keluarga Romanov yang menggunakan referensi sampel dari Pangeran
Phillip.
4. Studi genealogis/asal usul dan migrasi manusia
• Bagaimana dengan pemanfaatan
RNA di bidang Forensik???
 Daftar Bacaan
• DNA Forensik. Yoni Syukriani. Sagung Seto
• Ilmu Kedokteran Forensik dan Medikolegal FKUI
• An Introduction to Forensic Genetics. William Goodwin,
Adrian Linacre dan Sibte Hadi. Wiley
• Molecular Forensics. Ralph Rapley dan David
Whitehouse. Wiley
• Forensic DNA Analysis. Lawrence Kobilinsky, Louis
Levine dan Henrietta Margollis Nunno.
• Forensic DNA typing. Butler.2005