Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus

Guanajuato

The establishment of two transgenic goat lines for

mammary gland hG-CSF expression

TECNOLOGÍAS DE PRODUCCIÓN DE BIOMOLÉCULAS

7BM1
 Introducción
La producción de proteínas humanas recombinantes con usos farmacéuticos en la leche
de animales transgénicos a veces se denomina "pharming genético". Esta tecnología
puede superar las limitaciones que enfrentan los sistemas tradicionales de producción de
proteínas farmacéuticas recombinantes (altos costos, largo periodo de gestación,
camadas pequeñas).

Por estas razones, el uso de cabras lecheras como biorreactores proporciona ventajas
significativas. La glándula mamaria es el sitio preferido de producción de proteínas,
debido a las cantidades de proteínas que se pueden producir y la facilidad de
producción de proteínas.
Una vez que se ha producido una cabra que tiene un transgén integrado de forma
estable y que está expresando correctamente el gen en las glándulas mamarias,
puede iniciarse la propagación de un rebaño transgénico.

La proteína hG-CSF es fundamental para las defensas inmunológicas basadas en

neutrófilos, debido a su función reguladora en el crecimiento, la diferenciación, la
supervivencia y la activación de neutrófilos y sus precursores.

hG-CSF ha sido el factor de crecimiento hematopoyético más utilizado debido a su

eficacia comprobada contra diferentes formas de neutropenia y leucopenia
inducida por quimioterapia.
Objetivo

Producir el factor estimulante de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF)

en la leche de cabras transgénicas y propagar una manada transgénica de
producción.
 Metodología
Animales
 Cabras Canindé se usaron para la producción
de embriones pronucleares "in vivo“ (Once
hembras fertilizadas por dos machos).
 Cabras de una raza indefinida se utilizaron
como recipientes para los embriones
microinyectados
 Para mantener las líneas transgénicas y
generar progenie, los precursores transgénicos
se cruzaron con cabras Canindé no
transgénicas.
Producción de embriones pronucleares
 Los donantes de embriones fueron sometidos a un
tratamiento hormonal para la sincronización del celo y
promover la superovulación.
 Hembras receptoras recibieron mismo tratamiento que
donantes, con una inyección intramuscular adicional de
300 IU eCG 48 h antes del final del tratamiento.
 36 h después del tratamiento hormonal, los machos
(fertilidad comprobada) se aparearon con los donantes.
 Los donantes se mantuvieron en ayunas 24 h antes de la
cirugía, y los embriones se recuperaron 72 h después del
tratamiento hormonal.
Figura 1. Fragmento de ADN de 6391 pb digerido a partir del vector de expresión pGoatcasGCSF
utilizado para la generación de cabra transgénica

El transgén de hG-CSF se detectó con biopsias de

piel de oreja de cabras fundadoras dos semanas
usando la amplificación por PCR.
La identificación de animales transgénicos que llevan el ADN de
interés se realizó por PCR con dos pares de primers: PrA: 5’-AAA GGA
TAA GGCTAA TGA GG-3’, PrB: 5’-CGT TGT ACT TTT GTA CTG AGC-3’;
PrC: 5’-TCT GCA AAA GCA GGC TAA AGG-3’, PrD: 5’-GCC
AAG ACA CTC ACC CAT CAG-3’.
Figura 2. Diagrama de la estrategia utilizada para obtener progenie de las cabras transgénicas
fundadoras para la producción de hG-CSF.
 Lactancia inducida y cuantificación de hG-CSF en la leche

 La lactancia fue inducida hormonalmente en cabras de diez meses de edad (una transgénica y
otra no transgénica).
 Se administro estrógeno (0.25 mg / kg) y progesterona (0.75 mg / kg) con un total de siete
aplicaciones de cada una (14 días).
 En el día 13, se inyectó prednisolona (0,40 mg / kg) diariamente por tres días.
 Se tomaron muestras de leche durante aproximadamente 100 días.
 Seis muestras (inicio, mitad y final de la lactancia) de la fracción de suero se obtuvo por
centrifugación y la concentración de hG-CSF se determinó mediante un ensayo ELISA.
 Resultados
Todas las cabras que se utilizaron como donantes de
embriones respondieron al tratamiento hormonal y
produjeron 109 óvulos, incluidos 79 embriones (72,5%) en
la etapa pronuclear.

Después de la microinyección y la transferencia de

embriones, 12 receptoras quedaron embarazadas y
produjeron 18 cabritos, incluyendo un macho (10 M) y
una hembra (12 F) que portaban el transgén hG-CSF
(Fig. 3).

Por lo tanto, la tasa transgénica fue del 11.1% basado

en descendencia producida y 3.3% basada en
cantidad de embriones microinyectados /transferidos.
Figura 3. Identificación de cabras transgénicas con hG-
CSF usando análisis de PCR. Los amplicones producidos
por PCR a partir de ADN genómico con los cebadores
PrA/PrB (AB), PrC/PrD (CD) o β-actina (Act) se corrieron
en un gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción
con bromuro de etidio.
El macho demostró una libido normal y su
semen contenía espermatozoides normales
que portaban el transgén hG-CSF (Fig. 4).
Los análisis hematológicos de glóbulos
blancos en sangre periférica de las cabras
transgénicas (10 M y 12 F) y controles no
transgénicos de 45 a 280 días se muestran
en la Tabla 1.
Independientemente de los valores
promedio relativamente altos para cabras
transgénicas, los recuentos de neutrófilos no
fueron estables en el tiempo, disminuyendo
desde 45 a 160 días de edad.

Figura 4. La detección del gen hG-CSF en los

espermatozoides de 10 M mediante análisis de PCR. Los
amplicones producidos por PCR a partir de ADN genómico
con los cebadores PrA / PrB (AB), PrC / PrD (CD) o β-actina
(Acto) se corrieron en un gel de agarosa y se visualizaron
mediante tinción con bromuro de etidio.
A pesar de las oscilaciones de neutrófilos, no se detectó hG-CSF en muestras de suero usando un
ensayo ELISA de alta sensibilidad (desde 1 pg / ml).
Además, los hallazgos hematológicos no se acompañaron de cambios en otros recuentos de
células, mediciones de suero bioquímico (Tabla 2) o parámetros clínicos.
Por lo tanto, los recuentos de linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos, así como glucosa, urea,
creatinina, AST y ALT, temperatura rectal, frecuencia cardíaca y respiratoria para transgénicos y
no transgénicos estuvieron dentro de los rangos normales de valores para cabras (Pugh, 2002).
La concentración promedio de hG-CSF producida
por la hembra transgénica fue de 620,92 ± 179,93 μg
/ ml de leche.
Según el análisis de Western Blot, se detectaron dos
formas diferentes de hG-CSF en la leche de la cabra
transgénica, como se muestra en la Fig. 5.
Después de analizar la imagen usando una escalera
de proteínas como referencia, las bandas superior e
inferior de hG-CSF tenían pesos moleculares
aparentes de 19 y 16, 5 kDa, respectivamente.
El hG-CSF producido en bacterias se detectó como
una banda única de 17 kDa.

Figura 5. Expresión de hG-CSF en la leche de la cabra transgénica

12 F.
Para la determinación de actividad biológica de hG-
CSF en leche, se examino su efecto sobre las células
precursoras de la sangre del cordón umbilical humano
en la prueba de generación de colonias (Fig. 6).

La adición de la leche de la cabra transgénica que

contiene 50 ng/ml de hG-CSF produjo un aumento
significativo del número de colonias en comparación
con el control negativo con leche de cabra no
transgénica ((12.2 ± 4.2 versus 1.2 ± 0.9 CFU, P <0.01).

El mismo efecto fue producido por G-CSF bacteriano

recombinante administrado en la misma concentración
(14.3 ± 2.9 versus 1.2 ± 0.9 CFU, P <0.01).

Figura 6. Prueba de formación de colonias realizado en

sangre de cordón umbilical humano. Control negativo
(leche de cabra no transgénica), leche de cabra
transgénica (que contiene 50, 100 y 200 ng / ml de hG-
CSF) y control positivo (hG-CSF recombinante, Filgrastim,
50 ng / ml).
Figura 7. Análisis en microscopía de luz de las colonias formadas después de la adición de leche de cabra
transgénica. (A) 50 ng / ml (B) 100 ng / ml; y (C) 200 ng / ml de hG-CSF.

El examen morfológico de las colonias mostró que estaban compuestas de células granulocíticas
características en diferentes etapas de diferenciación (Fig. 7).
Hasta la fecha, los precursores han producido un total de nueve cabritos transgénicos (cuatro hembras y cinco
machos) y diez cabritos no transgénicos (cinco hembras y cinco machos).

En ambas líneas, 10 M y 12 F, el transgén se segregó equitativamente entre la descendencia masculina y

femenina y no se encontraron diferencias significativas (P> 0.05) entre los valores observados y la relación
esperada 1: 1.
 Discusión

 Se crearon dos precursores transgénicos mediante microinyección pronuclear con una construcción
de ADN que contenía el gen de hG-CSF fusionado al promotor de αs1-caseína de cabra.

 La tasa transgénica después de la microinyección pronuclear, obtenida en este estudio, fue mayor que
el rango informado previamente de 7-10% descrito para cabras (Baldassarre et al., 2004; Lee et al.,
2000).

 La tasa transgénica observada en este estudio también fue más alta que en nuestros informes
anteriores, en los que una cabra Saanen transgénica representó el 8,3% de los cabritos nacidos y el
0,7% de los embriones transferidos (Freitas et al., 2007).
 Se puede inducir hormonalmente la producción de leche de manera prematura para la detección
preliminar de la proteína recombinante de interés.

 Esto podría tener un impacto significativo en el proceso de toma de decisiones con respecto al
valor genético de un animal dentro de un programa de desarrollo de fundador transgénico.

 En este estudio, el precursor 12 F produjo más de 600 μg/ml de hG-CSF en su leche durante una
lactancia inducida. La cantidad real de hG-CSF en la leche fue aproximadamente 12 veces mayor
que los rendimientos obtenidos con la cabra transgénica producida por Ko et al (2000).
Conclusiones
 Se produjieron dos cabras transgénicas con un gen hG-CSF integrado de manera estable que eran
capaces de secretar hG-CSF recombinante de la glándula mamaria lactante sin causar ningún daño a la
salud de los animales.

 Tanto las cabras transgénicas machos como las hembras son verdaderas precursores ya que se demostró
que eran fértiles y capaces de transmitir el gen hG-CSF a la progenie de primera generación de cada
línea.

 Se requieren investigaciones adicionales con respecto a las características fenotípicas y genotípicas de las
líneas 10 M y 12 F.
Preguntas
¿Cómo se determino la actividad
¿Qué función tiene hG-CSF? biológica de hG-CSF?
Regulador el crecimiento, la Se examino su efecto sobre las células
diferenciación, la supervivencia y la precursoras de la sangre del cordón
activación de neutrófilos y sus umbilical humano en la prueba de
precursores. generación de colonias