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ANTICUERPOS MONOCLONALES

Y BIOLOGÍA MOLECULAR

M. Adriana Parra Blanco


2001
INTRODUCCIÓN
El sistema inmune (S.I.), es capaz de:

• reconocer a muchos antígenos (Ags.).


• responder ante ellos.
• mediante : - la generación de una gran
diversidad anticuerpos (Acs) linfocitos B (L.B.)
- la unión a Ags. por los receptores
de los linfocitos T (L.T.)
INTRODUCCIÓN
ANTES 1950 * HIPOTESIS INSTRUCTIVA

Ag modifica un Ac flexible ..... punto de unión complementario

1959 JERNE y BURNET * TE ORÍA SELECCIÓN CLONAL

Cada L.B.ó su progenie terminalmente diferenciada, la célula plasmática es


capaz de producir una sola clase y tipo de Ig, cuya región constante puede
modificarse durante la diferenciación del L.B., pero no así su región variable, la
cual mantiene su singular especificidad.
INTRODUCCIÓN

Durante años los investigadores trataron de


modificar experimentalmente a los Acs.
• para lograr su crecimiento estable.
• para asegurar una fuente continua de Acs.
homogéneos
Monoclonalidad .... mieloma
INTRODUCCIÓN
• Inducción de mieloma en ratón y su posterior
crecimiento “in vivo” e “in vitro”. (no específicos)
• Ensayos para transformar a los L.B. Con virus
Epstein Barr ó SV40.(muy poca cantidad)

• 1975 Cesar Milstein (argentino) y Georges Koehler


(alemán) ...HIBRIDOMAS (clon de células
híbridas)
HIBRIDOMAS
Milstein (1927) y Koehler (1946-1995)
lograron la fusión ó hibridación de dos células
somáticas:
• Un L.B. que posee información para sintetizar
una sola clase y tipo de Ac .y
• una CÉLULA DE MIELOMA que tiene la
capacidad ilimitada de proliferación celular
(inmortalidad)
Octubre 1984
Niels Kaj Jerne (inglés)
Cesar Milstein (argentino)
Georges Koehler (alemán)

PREMIO NOBEL DE
MEDICINA
PRODUCCIÓN DE HIBRIDOMAS

1 INMUNIZACIÓN: Dura meses, ratones Balb/c. Se


desarrolla atendiendo a las propiedades del Ag. y a
los propósitos a los cuales está destinado el Ac.
2 FUSIÓN: líneas celulares mielomatosas mutantes
para Timidina Kinasa (T), ó Hipoxantina - guanina
fosforribosiltransferasa (HGPRT) y que sido además
son sensibles a la aminopepterina.(A).
L.B. bazo, ganglios linfáticos, placas de Peyer.
Fusógenos: isolecitina ó polietilenglicol (PEG).
En medio con Aminopterina sólo
crecen los híbridos que gracias a los
L.B. poseen todo el panel de enzimas
de las vías de rescate de síntesis del
DNA y por lo tanto utilizan la
Hipoxantina y Timidina del medio.
PRODUCCIÓN DE HIBRIDOMAS

3 SELECCIÓN Y CRECIMIENTO : siembra en


placas (HAT) de células resultantes, sólo crecen los
híbridos. Se enriquece con esplenocitos que aportan
fact. de crecimiento, interleuquinas e intermediarios
metabólicos.
4 SUBCLONACIÓN Y CONGELACIÓN: Se hacen
diluciones límites para asegurar la monoespecificidad
de la línea celular.
Congelación en N2 líquido de células representativas
de cada etapa de crecimiento.
PRODUCCIÓN DE HIBRIDOMAS

5 CULTIVO MASIVO: Los hibridomas pueden ser


cultivados in vivo en la cavidad peritoneal de ratones
histocompatibles ó irradiados ............plasmacitomas
(20 mg/ml).

En sobrenadante de cultivo in vitro ( 20-50 ug/ml).


Para aumentar esta concentración pueden utilizarse
biorreactores del tipo fermentadores.
Policlonales monoclonales

composición heterogénea homogénea


reconocimiento varios epítopes un solo epítope
especificidad r.cruzadas (RC) mínimas R.C.
afinidad variable se selecciona
pureza Ag. es esencial hasta un 20%
rendimiento hasta 1mg/ml 100ug/ml – 20mg/ml
duración termine ilimitada
NUEVAS TECNOLOGÍAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

• ENDONUCLEASAS : Enzimas de restricción que


hidrolizan el DNA.
• CLONAMIENTO DE DNA : Enzimas que copian,
cortan y unen fragmentos específicos del DNA
• TRANSFERENCIA DE DNA EN SOUTHERN:
Se transfieren fragmentos de DNA de gel de agarosa
a filtros de nitrocelulosa y se identifican con sondas
marcadas.
NUEVAS TECNOLOGÍAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

• TRANSFORMACIÓN CELULAR: Se introducen


moléculas de DNA a otras células.
• SECUENCIACIÓN DEL DNA : Se determina el
orden, secuencia, de los desoxirribonucleótidos en
la cadena del DNA.
Donde empiezan y termina los procesos como
transcripción y traducción, existencia de intrones,
señales de control y otros.
NUEVAS TECNOLOGÍAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

• REACCIÓN DE POLIMERASA EN CADENA:


Método enzimático que permite amplificar un
segmento de DNA o RNA millones de veces.
Se requiere conocer la secuencia del segmento de AN
que se quiere analizar.
Estas secuencias conocidas servirán para sintetizar
oligonucleótidos denominados “partidores” o
“primers.”(5’-3’)
P.C.R.1985
Saiki,Erlich,Mullis.
• DENATURACIÓN.
• HIBRIDIZACIÓN O “ANNEALING”.
• EXTENSIÓN (Taq DNA POLIMERASA)

1 ciclo
32 CICLOS: 4.293.367.296
INGENIERÍA GENÉTICA
rediseño de las partes inmunogénicas del Ac.
• Anticuerpos de tipo quiméricos: combinación de
región variable de Ac. murino con región constante
de Ac. Humano. (conservar sus funciones efectoras).
• Anticuerpos de ratón humanizados: transplante de
regiones de reconocimiento antigénico del Ac. de
ratón en un Ac. humano.
• Anticuerpos con funciones adicionales no inmunes:
Se les acopla una droga ó una toxina.
• Fragmentos Fv: producidos en bacterias, aplicable a
todas las especies. (partidores adecuados).
Para no inmunizar animales ó seres
humanos,la ingeniería genética ha logrado
expresar sobre la superficie del fago
filamentoso M13 las regiones variables de
Acs. (VH-VL), en forma de fragmentos
moleculares (Fv), llamados Acs.coliclonales
con una determinada especificidad y
afinidad por un Ag.
APLICACIONES DE LOS
ANTICUERPOS MONOCLONALES.
INVESTIGACIÓN BÁSICA :

• Estructura y función de moléculas y células.


• Purificación y caracterización de receptores de
hormonas, factores de crecimiento y sus ligandos.
• Estudio de las metabólicas y enzimas involucradas.
• Organización del citoesqueleto y matriz exracelular.
APLICACIONES DE LOS
ANTICUERPOS MONOCLONALES.
INVESTIGACIÓN BÁSICA :.

• Caracterización de bacterias y toxinas.


• Mecanismos genéticos de la generación de la
diversidad de Acs.
• Caracterización del microambiente tímico.
• Análisis de los marcadores de superficie de los LT y
LB. (Clusters differenciation) CD.
APLICACIONES DE LOS
ANTICUERPOS MONOCLONALES.
MEDICINA:

• Mecanismos moleculares de numerosas patologías.


• En enfermedades sistémicas se pueden detectar Ags.
particulados y/o Acs. en circulación ó en tejidos.
• Prevención, tratamiento de patologías infecciosas.
• Sondas para la localización de tumores y metástasis,
acoplando radioisótopos de v/2 corta, permitiendo
evaluación dosimétrica precisa para la radioterapia.
APLICACIONES DE LOS
ANTICUERPOS MONOCLONALES.
BIOTECNOLOGÍA :

• Investigación, desarrollo y fabricación de vacunas


especialmente de reactivos de inmunodiagnóstico
preparados con sueros convencionales.
• Incorporación de esta tecnología en procesos
productivos de la industria farmacéutica, alimentaria
y petroquímica.
TIPOS DE HIBRIDOMAS.

• Heterohibridomas: Acs.bifuncionales capaces de


interactuar con 2 Ags. diferentes.
• Hibridomas humanos: Para evitar problemas de “no
compatibilidad”. Para aumentar el repertorio de Acs.
Para conocer las particularidades de la respuesta
inmune humana y ciertos aspectos de la estructura
antigénica no percibida por otros animales.
HIBRIDOMAS
HUMANOS.(dificultades)

• FUENTE DE L.B.: Inmunización repetida..

• ÉTICA: No es posible con la mayoría de los Ags.

• ESTABILIDAD: las líneas celulares mielomatosas


humanas no son tan estables como las de ratón.
Muchas gracias