CLSI M100-S22

Vol.32 No.3
January 2012
Performance Standars for
Antimicrobial Susceptibility
Testing, Twenty-First
Informational Supplement

QBP. Domingo Sánchez Francia

domingofrancia@hotmail.com
 I. EJECUCIÓN DE LAS PRUEBAS DE
SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS.

 Métodos para pruebas de susceptibilidad a los

Antimicrobianos de Bacterias anaerobias.

– CLSI Documet M11-A6 Vol. 24, No. 2 January 2006.

 Métodos para pruebas de susceptibilidad por dilución

en caldo y en agar del antimicrobiano de Bacterias que
crecen aeróbicamente.

– CLSI Document M07–A8 Vol. 29 No. 2, January 2009.

Ejecución de normas para pruebas
de susceptibilidad de difusión en
agar con disco de antimicrobianos
(antibiograma).
CLSI Antimicrobial Susceptibility Testing
Standars:

 M02 – A11, Vol. 32 N0. 1 January 2012.

 M07-A9, Vol. 32 No. 2, January 2012.

M100-S22 Vol. 32 No.3 and, January

2012; replaces M100-S20 and M100-S21-
U Vol.30 No. 1 and Vol. 30 No. 15. January
2011.
II. Indicaciones para realizar pruebas de
susceptibilidad a los antimicrobianos por el
método de difusión en agar con discos:

Se realizarán Pruebas de Sensibilidad en:

1. Cualquier microorganismo que
contribuya a un proceso infeccioso en
la que se permita:
Una terapia con antimicrobianos.
 Y la susceptibilidad no pueda ser
predecible.
2. Cuando el microorganismo causal
pertenezca a especies que son
capaces de exhibir resistencia a los
agentes antimicrobianos más
comúnmente usados.
• En los microorganismos que tengan
una susceptibilidad a los agentes
antimicrobianos predecibles.
• Y la terapia empírica es
ampliamente reconocida.
• No deben realizarse estas pruebas.
Ejemplo:
• Penicilina vs. Streptococcus
pyogenes.
• Las pruebas de susceptibilidad rara vez son necesarias
cuando la infección es debida a un microorganismo, es
reconocido como susceptible a una droga altamente
efectiva.

• Las Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos

son también importantes realizarlas en estudios de:

 Epidemiología de la Resistencia.

 Y en el Estudio de nuevos Agentes Antimicrobianos.

• Con Streptococcus pyogenes de
pacientes alérgicos a las
Penicilinas.
• La eritromicina, otros
Macrolidos y Lincosamidas
pueden ser probadas para
detectar cepas resistentes a
estos agentes.
III. Indicaciones Adicionales para la
Selección de los Antimicrobianos en
las pruebas de susceptibilidad.
1. La selección de discos con los
agentes antimicrobianos es decisión
de cada laboratorio en acuerdo con:
• El infectologo.
• La farmacia.
• Y el comité de control de infecciones.
2. Cada laboratorio deberá decidir que
agentes antimicrobianos reportará de
rutina.
 Y cuales reportarse en forma
selectiva.
3. Sólo se incluirá, para el reporte un
agente antimicrobiano de cada grupo.
• Ya que los resultados de los
antibióticos de cada grupo, son
generalmente similares.
• Y la eficacia clínica comparable.
4. Tipo de microorganismo, es decir:
 Gram positivo
 Gram negativo
 Anaerobio
 No Fermentador de glucosa
 De crecimiento lento o fastidiosos.

5. Número de microorganismos y especies

aisladas en muestras clínicas.
6. Producción de
enzimas por el
microorganismo.

7. Origen o fuente de la
muestra clínica.
8. Tipo de paciente es decir si es ambulatorio o si
se encuentra en el área hospitalaria.

9. Edad del paciente.

10. Farmacocinética del antibiótico.

11. Sinergismo y/o antagonismo existente entre

los diferentes grupos de antimicrobianos.

12. Dosis y vías de administración del antibiótico.

13. Costo.
 Interrelación Paciente –
Microorganismo - Antimicrobiano
IV. Selección de discos de antimicrobianos
para el reporte en las pruebas de
susceptibilidad de rutina.

• La selección de Discos con los Agentes

antimicrobianos, es decisión de cada Laboratorio
• El reporte de rutina de los antimicrobianos debe
estar basada en:
 Consideraciones microbiológicas.
En factores clínicos y farmacológicos.
Así como también en la aprobación de la FDA en
lo referente a las Indicaciones Clínicas y eficacia.
• El reporte de rutina al Médico deberá incluir solo
aquellos antibióticos que han sido valorados y
aprobados para uso terapéutico.

• Los antimicrobianos pueden ser adicionados o

suprimidos de las tablas básicas que propone el
CLSI.

• Los antimicrobianos que no han sido aprobados

para uso terapéutico también pueden ser probados
para proveer datos taxonómicos y epidemiológicos.
• Pero no se deben reportar al médico ni al Paciente.
• Los datos deberán estar disponibles para
el Infectólogo o para el Epidemiologo.

• Todos los antimicrobianos deben ser

reportados por su Nombre genérico
(Nombre de la Sal) y no por su nombre
comercial.

• Existe una relación muy estrecha entre

muchos antibióticos que pueden agrupar
conjuntamente varias clases de fármacos:
– Betalactamicos: Penicilina, Betalactamicos màs
inhibidores de Batalactamasas, Cefalosporinas,
Carbapenemicos y Monobactamicos.

– Glicopeptidos:
Vancomicina, Teicoplamina.

– Aminoglucosidos:
Amikacina, Gentamicina, Kanamicina.

– Macrolidos:
Eritromicina, Azitromicina, Claritromicina
• Tetraciclinas:
– Tetraciclina, Metaciclina

• Quinolonas:
– Ciprofloxacina, Ofloxacilina, Lomefloxacina.

• Sulfonamidas y Trimetroprin:
– Trimetropin-sulfametoxazol.

• Clase de drogas Únicas:

– Cloranfenicol, Rifampicina, Nitrofurantoina
 Guía de Selección:
 El número de agentes antimicrobianos probados deberá
ser limitado.

 Las Tablas del CLSI, incluyen los requisitos básicos para

la mayoría de los Laboratorios de Microbiología Clínica.

 Las tablas poseen columnas para organismos

específicos ò grupos de organismos y las Drogas
antimicrobianas están indicadas en orden de prioridad
para ser probados en la selección de baterías de
pruebas de rutina.
• Solo se incluirá un Agente Antimicrobiano
representativo de cada grupo de antimicrobianos.

• En algunas ocasiones la susceptibilidad de algunas

bacterias son predecibles por la susceptibilidad a otro
antimicrobiano diferente ejemplo:

 Staphylococcus sensible a Oxacilina basada en la prueba

de la Sensibilidad a Cefoxitina.

 Streptococcus pneumoniae sensible a penicilina basada

en la prueba de sensibilidad a oxacilina.
 Gran crecimiento que confluye alrededor
del disco de oxacilina refleja resistencia homogénea.
Una ligera patina alrededor del disco
de oxacilina indica heteroresistencia.
 Guía de Selección

Sugerida para el Reporte de pruebas selectivas y de

Rutina:

• En la Tabla 1 y 1A del CLSI están enlistados los

antimicrobianos en diferentes grupos con las
siguientes características:
 Grupo A:

 Antimicrobianos que son considerados

apropiados para incluirlos en las pruebas
de susceptibilidad de rutina en un panel de
pruebas primario.

Como también para el reporte de rutina de

los resultados de antibióticos para un
grupo de organismos específicos.
 Grupo B:

• Agrupa antimicrobianos que son

particularmente importantes en infecciones
nosocomiales y que pueden autorizarse en un
panel primario.

• Sin embargo, deberán ser reportadas solamente

SELECTIVAMENTE o cuando el organismo es
resistente a los agentes del Grupo A.

• Otras indicaciones para reportarlos incluye la

fuente de la muestra…
 Ejemplo:

Cefalosporinas de 3ª. generación para bacilos

Gram negativos.

Trimetropin sulfametoxazol para infecciones de

las Vías Urinarias.

Infecciones Polimicrobianas.

Infecciones que involucren sitios múltiples.

 Cuando se solicita en caso de alergia-
intolerancia.

 Falta a la respuesta a un Agente

antimicrobiano del Grupo A.

 Para reporte al Comité de Infecciones

como una ayuda epidemiológica.
 Reporte Selectivo:
• Cada laboratorio deberá decidir que agentes
antimicrobianos de la Tabla 1 y la Tabla 1A del
CLSI reportará de rutina (Grupo A).
 Y cuales poder ser reportados solamente en
forma selectiva (del Grupo B).
 En acuerdo con el Infectologo.
 La Farmacia.
 El Comité de Control de Infecciones
Nosocomiales.
 Y El Comité Para el Uso Prudente y Apropiado
de Antibióticos.
• El reporte selectivo deberá ayudar a
improvisar la relevancia clínica de las pruebas
reportadas.
Y ayudará a minimizar la selección de cepas
nosocomiales multirresistentes por el abuso
de agente de amplio espectro.
• Los resultados de agentes del Grupo B no
deberán ser reportados rutinariamente.
Estarán disponibles en peticiones especiales.
O deberán ser reportados en muestras
selectivas.
 Grupo C:
• Incluye agentes antimicrobianos
suplementarios o alternativos que pueden
requerirse en las pruebas de susceptibilidad de
Instituciones que alberguen cepas epidémicas ò
endémicas.
• Resistentes a varias drogas primarias
(especialmente de la clase de los
Betalactamicos o Aminoglucósidos).

• Para el tratamiento de pacientes alérgicos a

drogas primarias.
• Para tratamiento de microorganismos
inusitados (ejemplo: Cloranfenicol para
Salmonella sp o algunas Pseudomonas
sp).

• Para reportar a Comitè de Control de

Infecciones como una ayuda
epidemiologica.
 Grupo U
Se enlista agentes antimicrobianos para vías
urinarias.

Ejemplo:
Nitrofurantoina y algunas quinolonas como
Lomefloxacina ú ofloxacina Cuyo uso terapéutico
esta limitado al tratamiento de infecciones de las
Vías Urinarias.

 Estos antimicrobianos no debe ser probados

contra patógenos recuperados de otros sitios
que no sea la orina.
 V. Reactivos para la prueba de
difusión con disco
• Agar Mueller – Hinton.

– Ha demostrado buena
reproducibilidad en las
pruebas de susceptibilidad
de lote a lote.

– Tiene una concentración

baja de Sulfonamidas,
Trimetopin, Tetraciclina e
Inhibidores.
• Proporciona crecimiento satisfactorio de muchos
patógenos no fastidiosos.

• Se tiene una gran cantidad de Información en

Experiencias con este medio en lo referente a
pruebas de susceptibilidad.

• El Medio de Mueller – Hinton debe ser probado

cuando algún lote no cumpla con los seguimientos o
los límites aceptables del Documento M6 -protocolo
para evaluación de agar deshidratado Mueller –
Hinton para el uso por cambio de lote.
Preparación de Agar Mueller – Hinton

• Prepararse conforme a las instrucciones del fabricante.

• Después de esterilizar, permita que se enfríe en baño

de agua entre 45-50 °C.

• El Medio fresco, recién preparado y enfriado es

depositado dentro de cajas de petri, en una superficie
horizontal nivelada, que le proporcione una
profundidad de aproximadamente 4 mm.

• Esto corresponde a vaciar 60-70 ml. de medio en

placas de 150 mm de diámetro o 25 – 30 ml. en placas
de 100 mm de diámetro.
• La superficie de las placas deben ser
flameadas.

• El medio debe enfriarse a temperatura

ambiente, y a menos que se usen el mismo
día deberán almacenarse en refrigeración
(2-8 °C con una media de 4-6 °C).

• Las placas deben usarse dentro de los 7

días después de la preparación.
• A menos que se tomen precauciones
adecuadas.
• Como envolver en bolsas plástico para
evitar evaporación.
• Las placas tienen que mostrar que
funcionan adecuadamente con los
microorganismos control.
• Una muestra representativa de cada lote
deberá ser examinada para probar la
esterilidad, incubando de 35–37°C por 24
horas para bacterias.
 pH
• El pH de cada lote de Mueller – Hilton deberá ser checado
cuando el medio sea preparado.

• El medio deberá tener un pH entre 7.2 – 7.4 a temperatura

ambiente.

• Si el PH esta por abajo de este rango ciertos

antimicrobianos pierden potencia (aminoglucósidos,
quinolonas y macrolidos), aunque otros parecen tener una
mayor actividad (Tetraciclinas).

• Si el pH es alto (por arriba del rango marcado), efectos

opuestos serán esperados.
 HUMEDAD

• Antes de usar en las pruebas de

rutina, si la humedad esta
presente en la placa con el medio
de cultivo, las placas deberán
incubarse en una estufa a 35°C
de 10 – 30 minutos.
 Efecto de la Timidina o Timina
• El medio que contenga un exceso de Timina o
Timidina puede revertir el efecto inhibitorio de
las sulfonamidas y el trimetropin.

• De este modo baja el rendimiento y producen

zonas de crecimiento reducidas o continuas en
estos antibióticos, pudiendo resultar en
reportes de falsas resistencias.

• El Agar Mueller – Hilton con baja concentración

de Timidina deberá ser usado.
• Un nuevo lote de Agar Mueller–Hilton deberá
ser evaluado con una cepa de Enterococcus
feacalis ATCC 29212 ò 33186 con los discos de
Trimetropin – Sulfametoxazol.

• Un medio satisfactorio proveerá esencialmente

zonas claras o zonas de inhibición de 20mm. o
más de diámetro.

• Un medio Insatisfactorio no producirá zonas de

Inhibición, permitiendo un crecimiento junto al
disco o zonas de inhibición reducidas.
 Efectos de Variación de Cationes
Divalentes:
• La variación en cationes divalentes,
principalmente magnesio y calcio, afectará los
resultados de las pruebas de aminoglucosidos,
Tetraciclinas, Colimicina con cepas de
Pseudomonas aeruginosa.

• El exceso de contenido de cationes reducirá el

tamaño de las zonas, mientras que el
contenido bajo de cationes resultará en
grandes zonas de inhibición inaceptables.
 Cepas probadas que fallan en crecer
satisfactoriamente
• Las cepas de Streptococcus sp fallan en crecer
satisfactoriamente en Agar Mueller – Hilton
nutritivo, algunos suplementos como sangre de
carnero desfibrinada, deberá adicionarse a este
medio fundido y frío a una concentración final
de 5% (v/v).

• Cuando se agrega Sangre al medio Mueller–

Hilton, las zonas de inhibición con discos de
Oxacilina y Meticilina seran ligeramente
menores (2–3 mm.) que los obtenidos en Medio
sin suplemento.
• Esta situación puede resultar en
zonas de inhibición mas bajas
con S. aureus ATCC 25923 en lo
que respecta a los rangos
aceptables definidos en la Tabla
No. 3 de la CLSI:
• La Sangre de Carnero puede causar
zonas continuas o una película de
crecimiento fino dentro de las zonas de
inhibición alrededor de los discos de
Sulfonamidas y Trimetropin.

• Revise las guías para organismos

fastidiosos.
 VI.- Reactivos para la prueba de
difusión con disco.
• Almacenamiento de los Discos de
Antimicrobianos:

Los cartuchos que contienen los discos con

antimicrobianos están empacados en
condiciones anhidras.

Los cartuchos serán refrigerados de 2-8 °C. o

congelados a temperaturas de -20 ºC ò
menores si es necesario.
• Los cartuchos que contengan discos de
Batalactamicos deberán ser guardados
congelados
• No es recomendable congelar y
descongelar por que este procedimiento
afecta la concentración del antibiótico.

• Una vez descongelados los Betalactamicos

se mantendrán en condiciones adecuadas
en refrigeración.
El contenedor de los
cartuchos de los discos
deberá ser retirado del
refrigerador ò del
congelador 0.5 – 1 hora
antes de ser usado con la
finalidad de que tome la
temperatura ambiente
antes de abrir el cartucho.
• Únicamente un cartucho de discos debe ser
retirado del Empaque ó la caja y deberá estar
sellado y contener desecante.

• Cuando se use un aparato dispensador de discos,

este deberá estar en buen estado, con la cubierta
apretada y con desecante adecuado.

• El dispensador debe atemperarse a temperatura

ambiente antes de su uso.

• El desecante deberá reemplazarse cuando exista

un cambio de color en el indicador por exceso de
humedad.
• Cuando no se use el Dispensador de discos
deberá ser guardado en refrigeración.

• Solamente los discos que tengan una

fecha de caducidad adecuada deberán ser
usados.

• Discos caducados deberán ser desechados

y no deben ser utilizados.
 Estándar de Turbidez para la Preparación
del Inoculo:
La estandarización de la densidad del Inoculo
para las pruebas de Susceptibilidad equivale a
un Standard turbidimetrico de BaS04, para lo
cual se a adoptado el standard 0.5 de
McFarland o su equivalente óptico.
Ejemplo: Suspensión de partículas de látex.

El Standard de BaS04 0.5 de McFarland será

preparado como sigue:
 Solución A:
 Se prepara una solución de BaCl2 0.048 M/L ó 1.175%
p/v BaCl22H20 en matraz aforado de 100mL.
 Solución B:
 Solución de H2SO4 0.18 M/L (0.36 N) ó 1% v/v en
matraz aforado de 100mL.
 Colocar 0.5 mL de la solución A y llevar a 100 mL en
matraz aforado con la solución B agitando
constantemente.
• La correcta densidad de Standard de Turbidez deberá
ser verificada usando un espectrofotómetro con una
cubeta de 1cm de paso de luz y determinando la
absorbancia a 625nm, esta deberá ser de 0.08-0.10
para el Standard 0.5 de McFarland.
La suspensión de Sulfato de
Bario deberá transferirse a
tubos de tapón de rosca en una
cantidad de 4-6 ml, similares a
los que usen para el
crecimiento del inoculo
bacteriano.
 Estos tubos serán apretados, sellados y
almacenados en la oscuridad a temperatura
ambiente.
 El Standard de turbidez será agitado
vigorosamente en un vortex antes de cada uso
y será inspeccionado para ver su turbidez
uniforme.
 En caso de aglomeraciones de partículas será
desechado.
 El Standard de Sulfato de Bario deberá ser
reemplazado o verificada su densidad
mensualmente.
 VII.- Procedimiento para la ejecución de la
prueba de difusión con disco.
• Preparación del Inoculo:

• Método de Crecimiento en caldo nutritivo:

– Deben ser seleccionadas de 1-2 colonias

perfectamente aisladas, del mismo aspecto
morfológico.
– La colonia debe ser tomada con una aza y
transferida a un tubo que contenga 4- 5 ml de un
caldo de cultivo conveniente como caldo soya
tripticasa o caldo Mueller – Hilton.
• El caldo de cultivo es incubado a 35ºC hasta que iguale ò
exceda la turbidez del Standard 0.5 de Mc.Farland
(usualmente 2 – 6 horas). Esta suspensión contiene
aproximadamente 1 – 2 X 108 UFC/ml.
• (100 – 200 millones de UFC/ml.)

• La turbidez del crecimiento activo del caldo de cultivo es

ajustada con Solución salina estéril o con caldo soya
tripticasa, hasta obtener una turbidez óptimamente
comparable al Standard 0.5 del McFarland.

• En la realización de este paso particular, un artificio

fotométrico puede ser usado, o si lo ejecuta visualmente ,
es necesaria luz adecuada ayudando en la comparación
visual del tubo del inoculo contra el standard 0.5 McFarland
en una tarjeta blanca y contrastando contra 2 líneas negras.
 Método de Suspensión Directa de
Colonias:
• Como alternativa conveniente para el
método de Crecimiento, el inoculo puede ser
estandarizado por la suspensión directa de
las colonias seleccionadas en caldo o en
solución salina de una placa de agar de 18 –
24 hrs, de crecimiento ( en un medio no
selectivo como agar sangre, AST o AGCH).
• La suspensión será ajustada por
comparación al standard de turbidez 0.5 de
McFarland.
• Esta aproximación al Método de Crecimiento
tradicional, es el Método seleccionado para
probar organismos fastidiosos como:
Haemophilus sp., N. gonorrhoae y S.
pneumoniae y para probar Staphylococcus
Meticilino u Oxacilino resistentes.

• Los Métodos Comerciales alternativos que

permiten la Estandarización directa del Inoculo
sin ajuste de turbidez y sin preincubación en un
caldo de cultivo pueden también ser aceptables
para propósito de pruebas de rutina
“aceptando” que hay suficiente información de
la densidad del Inoculo final.
• Cuando se prueban discos de
Trimetropin–Sulfatoxazol por este
método, las colonias obtenidas de
un medio de crecimiento no
selectivo, pueden producir un “velo”
de crecimiento dentro o de la zona
de inhibición producida por cepas
susceptibles.
 Inoculación de las Placas de Prueba:

• Dentro de los 15 minutos después del ajuste

de la turbidez de la suspensión del inoculo,
un hisopo de algodón se introducirá dentro
de la suspensión ajustada.

• El hisopo deberá ser rotado varias veces

presionando firmemente en las paredes de
Tubo para eliminar el exceso de Inoculo.
• La superficie de la Placa de agar
Mueller – Hilton deberá ser inoculada
por estriamiento masivo.

• Este procedimiento se repetirá 2

veces más, rotando las placas 60° en
cada proceso de estriamiento masivo,
para la distribución homogénea del
inoculo.
d) Estándar del inoculo
e) Inoculación de las placas de prueba
o La tapa de la placa se dejará entreabierta de 3–
5 minutos, pero no más de 15 minutos
o para permitir que el exceso de humedad pueda
ser absorbida antes de aplicar los discos
impregnados con los antibióticos.

• Nota: Los inóculos extremadamente densos

deberán ser evitados.
• Nunca use cultivos de toda la noche sin diluir.
• O inóculos no estandarizados para estriar las
placas de Agar Mueller – Hilton.
 Aplicación de los Discos en las Placas de
Agar Inoculadas:

• El Laboratorio deberá de tener predeterminada la

batería de antibióticos que aplicará en la placa de agar
inoculada.

• Cada disco deberá ser presionado para que tenga un

contacto completo con la superficie del agar.

• Los discos se aplicaran a una distancia no menor de

30mm de centro a centro del disco.
• Distancia entre los
discos: >30 mm de centro
a centro.

• Placas de 150 mm: 9 o

12 discos.

• Placas de 100 mm de
diámetro: 4 o 5 discos.
• En forma ordinaria no deberá de usarse
más de 12 discos para placas de 150 mm.
• Y 5 discos para placas de 100 mm de
diámetro.

• Algunas de estas drogas difunden

instantáneamente y un disco no deberá ser
recolectado una vez que haya estado en
contacto con la superficie de Agar.
g) Condiciones de incubación
• Las placas serán invertidas e incubadas a 35º C dentro
de los 15 minutos después de la aplicación de los
discos.

• Solo las placas de prueba con cepas de Haemophilus

sp, N. gonorrhoeae y S. pneumoniae deberán incubarse
en atmósfera de CO2.

• Los Estándares interpretativos fueron desarrollados

usando una incubación en aerobiosis.
• El CO2 altera significativamente el tamaño de la zona
de inhibición de algunos agentes antimicrobianos.
 Lectura de Placas e interpretación de
resultados.
• Después de 16 a 18 horas de incubación, cada
placa será examinada.

• Si la placa fue satisfactoriamente estriada, y el

inoculo fue correcto, los resultados de las zonas de
inhibición serán uniformemente circulares y el
crecimiento será confluente.

• Los diámetros de las zonas de inhibición

completas serán medidas incluyendo el diámetro
del disco.
 Interpretación de los resultados
• Visualizar el estriado adecuado
y la densidad del inoculo.

• Empleando un vernier o regla,

medir los halos de inhibición en
milímetros, invirtiendo las cajas
petrí.

 Las zonas de inhibición serán

interpretadas de acuerdo a la
tablas del CLSI (M100).
VII .-Métodos de susceptibilidad para microorganismos
fastidiosos o crecimiento lento.

• El medio de Mueller- Hilton ha sido descrito para

patógenos aerobios y de crecimiento rápido y no es
adecuado para microorganismos fastidiosos.

• Si las pruebas de difusión con disco deben ser

realizadas con microorganismos fastidiosos, el medio,
Los procedimientos de Control de Calidad y el criterio
de interpretación deberá ser modificado para cada
organismo en particular.

• Las pruebas de difusión para H. influenzae, N.

gonorrhoeae y S. pneuminiae han mostrado SER
EXACTAS Y PRECISAS.
• Otros organismos fastidiosos pueden ser
probados por un método de difusión como se
describe en el documento M2-A8 de la CLSI.

• Las bacterias anaerobias NO DEBEN SER

PROBADAS por las pruebas de difusión con
Disco, el documento M1 1 de la CLSI es el
procedimiento de pruebas apropiado para
Bacteria Aerobias.
• Para preparar el Medio HTM, primero necesitamos
preparar una solución stock fresca de Hemoglobina,
disolviendo 50 mg de polvo en 100ml. de NaOH 0.01 / N
(0.01 mo1/L) calentado y agitando el polvo hasta su
completa disolución. 30ml de solución stock de
Hemoglobina es adicionado a 1 L de AMH con 5 gr. De
extracto de levadura, después de esterilizar y enfriar,
agregar 3 ml de la solución stock (NAD 50mg disuelto 5 en
10ml de Agua destilada) esterilizar por filtración) y
adicionar asépticamente.

• Nota. El Agar Chocolate. Mueller – Hilton no es

recomendado para pruebas de rutina de especies de
Haemophilus.
 A).- Haemophilus especies
a).- Medio de Agar.

• El medio de elección para las pruebas de difusión con disco de especies de

Haemophilus es el Medio de Prueba de Haemophilus (HTM), es un Agar
con los siguientes ingredientes:

• Agar Mueller – Hilton (AMH).

• Beta - NAD

• 15 ug/ml de NAD

• 15 ug/ml de Hemoglobina bovina.

• 5 mg/ml de extracto de levadura.

• PH – 7.2 – 7.4
 b).- Procedimiento de Prueba.

• El procedimiento de suspensión directa de las

colonias deberá ser usada cuando se quiera probar
especies de Haemophilus.

• Use colonias que hayan crecido en Agar Chocolate

(20 – 24 hrs) y tomadas directamente, realice una
suspensión de este microorganismo en caldo Mueller
– Hilton o solución salina 0.9 %.

• La suspensión deberá ser ajustada a la turbidez

equivalente al standard 0.5 de McFarland usando el
artificio fotométrico.
• Esta suspensión deberá contener 1 –4 X 10 8 UFC ml
deberá ser cuidadoso en la preparación de esta
suspensión por que altas concentraciones del Inoculo
pueden aportar resultados de falsa resistencia con
algunos antibióticos Beta Lactamicos, particularmente
con cepas productoras de Betalactamasas de H.
influenzae que sean probadas.

• Dentro de los 15 minutos después del ajuste de la

turbidez de la suspensión del inoculo, deberá ser
inoculada la placa de Agar.
• El procedimiento para probar los discos de los
antibióticos deberá ser idéntico a como se realiza
para los microorganismos no fastidiosos, excepto
que no mas de 9 discos serán aplicados en la
superficie de una placa de agar de 150 mm o no
mas de 4 discos en placas de 100mm de
diámetro.

• Las placas serán incubadas a 35º C en atmósfera

de 5 % de CO2 por 16 –18 horas antes de medir
las zonas de inhibición.

• La mayor parte de la zona de adentro del

crecimiento inhibido deberá ser considerada
como zona marginal.
 c).-Criterios de Interpretación de lo Diámetros de las
Zonas.

• Los antimicrobianos sugeridos para las pruebas de

rutina de las Especies de Haemophilus son indicadas en
la tabla IA del CLSI.

• Los diámetros de zona especifica para criterios de

interpretación deberá ser usado cuando se prueben
cepas de Haemophilus, esta representada en la Tabla
2ª. De la CLSI.

• Las pruebas de difusión con discos de otros

antimicrobianos para Haemophilus NO SON
RECOMENDADAS.
 VIII.- Métodos de susceptibilidad para
microorganismos fastidiosos o de crecimiento
lento.
B).- Streptococcus pneumoniae.

• Medio de Agar.

• El medio recomendado para probar la susceptibilidad

de S. pneumoniae es el Agar Mueller – Hilton
suplemento con 5% de sangre de Carnero
desfibrinada. El medio preparado usando otro medio
base u otras sangres no son recomendados.
 Procedimiento de Prueba.

• El procedimiento de la suspensión directa de

las colonias deberá ser empleado como
sigue:

• El crecimiento de toda la noche de una placa de

Agar Sangre de Carnero ( 18 – 20hrs.) es
suspendida en Caldo de Mueller – Hilton o
solución salina 0.9 % a una densidad equivalente al
Standard 0.5 de McFarland. Dentro de los 15
minutos, después del ajuste de la turbidez de la
suspensión del inoculo, este deberá ser usada para
la inoculación de la placa de agar.
• Los procedimientos para probar los discos son
antibióticos por difusión será idéntico a como se

• Realiza para bacterias no fastidiosa, excepto que no

mas de 9 discos de antimicrobianos deberán ser
aplicados en la superficie de la placa de Agar de 150
mm y no mas de 4 discos en las placas de Agar de
100mm de diámetro.

• Las placas serán incubadas a 35º C en una atmósfera

de 5 –7 % de CO2 por 20 – 24 hrs antes de medir las
zonas de Inhibición.
 Criterios de Interpretación de los Diámetros de
las Zonas de inhibición.

• Los agentes antimicrobianos que son

sugeridos para las pruebas de rutina de los
neumococus son indicados en la Tabla 1A
del CLSI. Los criterios específicos de
interpretación de los diámetros de las zonas
cuando se prueben S. pneumoniae son
enlistados en la Tabla de la CLSI.
• Nota: Los aislamientos de S. pneumonie con
diámetros mayores o iguales a 20 mm con discos
de Oxacilina son susceptibles (MIC < 0.06 ug/ml)
a Penicilina. La prueba de disco sin embargo no
distingue cepas intermedias (ejemplo; MIC 0.12 –
1.0 ug/ml) de cepas que son resistentes (ejemplo:
MIC > 2-0 ug/ml). Un MIC deberá ser
determinado en aislamientos de S. pneumonieae
con diámetros de zona < 19mm, usando discos de
Oxacilina.
 Métodos de susceptibilidad para Microorganismos
fastidiosos de crecimiento lento.

• C).- Neisseria gonorrhoeae.

• Medio de Agar.

• El medio recomendado para pruebas de N. gonorrhoeae

consiste en Agar Gelosa Chocolate al que se le adiciona al 1%
suplemento de crecimiento después de la esterilización del
medio.

• El suplemento de crecimiento libre de Cisteina no es requerido

para pruebas de difusión con disco. El Agar Chocolate
enriquecido NO ES RECOMENDABLE para pruebas de
susceptibilidad de N. gonorrhoeae.
 Procedimiento de prueba.

• El procedimiento de la suspensión directa de las

colonias deberá ser usado cuando se prueba N.
gonorrhoeae. Use colonias de un crecimiento de toda
la noche de Agar Chocolate, una suspensión
equivalente al standard 0.5 de McFarland es preparado
en Caldo Mueller – Hilton o en solución salina 0.9 %.
Dentro de los 15 minutos después de ajustar la
turbidez de la suspensión del Inoculo, este deberá ser
usado para la Inoculación de la placa de Agar.
• Los procedimientos para probar los discos con
antibióticos por difusión será idéntico a como se
realiza para los microorganismos no fastidiosos, no
mas de 9 discos de antimicrobianos deberán ser
aplicados en la superficie de la placa de Agar de
150mm y no mas de 4 discos en las placas de 100mm
de diámetro.

• Las placas serán incubadas en una atmósfera de 5 %

de CO2 por 20 – 24 hrs. antes de medir las zonas de
inhibición.
 Criterios de Interpretación de los Diámetros
de las Zonas.
• Los criterios de interpretación de los diámetros de las zonas
especificas deberán ser usados cuando se pruebe
N.gonorrhoeae son alistados en la Tabla 1A de la CLSI.

• Existen 3 categorías especificas de susceptibilidad definidas

para N. gonorrhoeae basada en la taza de respuesta
determinada en estudios clínicos, ejemplos “Susceptible”,
“Intermedia” y “Resistente”.

• Vea la tabla 2F para la definición precisa de cada categoría.

• Nota: Organismos con diámetro de zonas de
inhibición <19mm con disco de 10ug de
Penicilina, generalmente producen
Betalactamasas. Sin embargo, las pruebas de
Beta Lactamasas son rápidas y son por lo tanto
preferidas el reconocimiento de la resistencia
mediada por plásmidos. Organismos con
resistencia mediada por plásmidos proveen
zonas de inhibición para tetraciclinas < 19 mm.