YULIA ANDINA A 141 058

KELOMPOK : 6 ANGGUN YUNIA L. A 141 078

SEKOLAH TINGGI FARMASI INDONESIA HANI NURHANIFAH A 141 073
BANDUNG
2018
DINI AYU O. A 141 089
Latar Belakang
Leptospirosis adalah penyakit infeksi akut yang dapat menyerang
manusia yang disebabkan bakteri Leptospira spp. dan
digolongkan sebagai zoonosis. Gejala klinis leptospirosis yang
tidak spesifik dan sulitnya uji laboratorium untuk konfirmasi
diagnosis mengakibatkan penyakit ini seringkali tidak
terdiagnosis. Oleh karenanya perlu dilakukan optimasi uji
diagnostik molekuler menggunakan real-time PCR sebagai
deteksi cepat Leptospira patogen yang sensitif dan spesifik.
Penelitian ini di desain untuk mengoptimatisasi uji diagnostik
molekuler menggunakan real time-PCR sebagai metode yang
sensitif dan spesifik untuk mendeteksi Leptospira.
Lanjutan…
Pada bulan Maret 2012 terjadi peningkatan
kasus leptospirosis di Ponorogo. Sebanyak
11 kasus leptospirosis dilaporkan oleh Dinas
Kesehatan Kabupaten Ponorogo. Penelitian
ini bertujuan untuk mendeteksi bakteri
Leptospira patogen menggunakan Lepto Tek
Lateral Flow dan metode Polimerase Chain
Reaction (PCR).
LeptoTek Lateral Flow Assay Polimerase Chain Reaction (PCR).
PENDAHULUAN
KLASIFIKASI : Karakteristik :
• Leptospira antara lain berbentuk spiral,
Kingdom : Monera dapat hidup di airtawar selama satu
Phylum : Spirochaetes bulan, bersifat patogen dan saprofitik.
Class : Spirochaetes • Spesies Leptospira yang mampu
Order : Spirochaetales menyebabkan penyakit (patogen) bagi
Family : Leptospiraceae manusia adalah Leptospirainterrogans.
Genus : Leptospira • Leptospirosis disebabkan bakteri
Species : Leptospira pathogen berbentuk spiral termasuk
genusLeptospira, famili leptospiraceae
interoogans dan ordo spirochaetales.
• Spiroseta berbentuk bergulung-gulung
tipis, motil, obligat, dan berkembang
pelan secara anaerob.
 ETIOLOGI
https://regitajune97.wordpress.com/201
3/05/18/bakter-leptospira-penyebab-
leptospirosis/
 Alat dan Bahan

Alat Bahan
1. Tabung sampel darah vakum 1. Sampel darah (whole
yang mengandung EDTA blood),
2. Sarung tangan
2. Sampel urin,
3. Mikropipet berbagai ukuran
serta tipnya 3. Kit Isolasi DNA
4. Tabung mikro 1,5 ml steril, 4. Etanol absolut
sentrifus, 5. Kit PCR, primer
5. Waterbath dan alat
thermalcycler. 6. Tabung PCR,
 Pengambilan
Sampel
(Darah & Urin)

Sampel
diperiksa
dengan dua
metode

RDT (Rapid Metode

Diagnostic Polymerase
Test) =Leptotek Chain Reaction
Lateral Flow (PCR).
1. LeptoTek Lateral Flow Assay
Sampel darah Lepto Tek Lateral Hasil
flow.

• Disentrifugasi • Hasil
untuk diambil • Lubang A : diteteskan serum pemeriksaan
serumnya darah dengan Leptotek
• Serum darah • Lubang B : diteteskan buffer didukung dan
diambil sebanyak 5 tetes (ditunggu diperkuat dengan
sampai 15 menit dan dibaca pemeriksan PCR
hasilnya)

Serum darah mengandung bakteri

Leptospira
• positif : jika muncul garis merah
pada kontrol (C) dan pada garis
IgM dan/atau IgG.
• Negatif : Bila hanya muncul satu
garis merah pada kontrol (C)
2. Polimerase Chain Reaction (PCR).

Sampel (PCR)
Darah lengkap dan urin
deteksi DNA
• diisolasi dari 200 μl Leptospira • Primer PU1, dan
sampel darah dan LepR1 akan melekat
sampel urin penderita. • metode Conventional pada conserved region
• menggunakan High Pure PCR dengan dari sekuen 23S rDNA
PCR Template menggunakan primer Leptospira patogen.
Preparation Kit (Roche) yang didesain oleh
Kositanont
DNA
Leptospira
Sekuen primer yang digunakan :
Polimerase Chain
Reaction
• menggunakan Dream
Taq Green Mastermix
(Fermentas)
Program (i) Program (ii)
• predenaturasi 1 • (ii) amplifikasi 35 siklus:
siklus: 94 °C 94 °C selama 1 menit,
selama 5 menit; • annealing 50 °C
selama 1 menit,
ekstensi 72 °C selama
1 menit

PCR Program (iii)

• dielektrofresis pada gel • ekstensi akhir 1 siklus:
agarose 1,5 % dan 100 bp 72 °C selama 7 menit
ladder digunakan sebagai
marker untuk menganalisis
besar produk PCR.
 Data Pengamatan
Ditemukan 4 sampel yang positif
mengandung DNA Leptospira
pathogen:
- Dua sampel dari darah (whole
blood) dan dua sampel dari
urin.
615 bp
- Sampel positif pemeriksaan
PCR pada darah dan hasil
pemeriksaan leptoteknya
negative.
- sedangkan sampel positif
pemeriksaan PCR pada urin,
Gambar 1. hasil leptoteknya positif.
Hasil Elektroforesis Produk PCR yang Positif
Mengandung Bakteri Leptospira Patogen pada
Sampel Urin (lane 1) dan Sampel Darah (lane 2)
• Pada penderita yang positif PCR dan leptoteknya positif
pada (sampel urin) disebabkan karena Bakteri Leptospira
akan dikeluarkan melalui urin apabila penderita
leptospirosis telah memasuki fase imun, yaitu setelah hari
ke-10 sejak bakteri memasuki tubuh penderita.
• Pada fase ini, antibodi dalam tubuh mulai terbentuk, dan
titernya telah mencukupi untuk dideteksi menggunakan
alat diagnostik untuk deteksi antibodi.
Tabel 2. Perbandingan hasil pemeriksaan sampel
menggunakan PCR dan Leptotek Lateral Flow

Data pemeriksaan Leptotek dari penderita yang positif terinfeksi

Leptospira patogen berdasarkan pemeriksaan PCR

 Penderita leptospirosis pada fase bakterimia yang ditemukan dalam

penelitian ini pemeriksaan leptoteknya menunjukkan hasil negatif.
 disebabkan karena kemungkinan pada fase tersebut antibodi anti
Leptospira belum terbentuk dalam tubuh penderita
Bahwa penderita dengan hasil pemeriksaan PCR
positif dari sampel darah, seluruhnya dalam kondisi
demam, sedangkan penderita dengan hasil
pemeriksaan PCR positif dari sampel urin tidak
menunjukkan gejala klinis yang khas.
Pembahasan :
 Pemeriksaan baku atau standar (Gold Standard) untuk diagnosis
leptospirosis yang masih diakui sampai saat ini yaitu menggunakan metode
Microscopic Agglutination Test (MAT). Tetapi pemeriksaan ini memiliki
kelemahan yaitu hanya mendeteksi antibodi.
 Pemeriksaan dengan MAT tetap menjadi Gold Standard untuk pendekatan
serologi, namun kurang efektif bila digunakan dalam deteksi dini.
 Pemeriksaan PCR dapat menjadi salah satu alternatif metode pemeriksaan
yang dapat digunakan untuk deteksi dini dan juga dapat dilakukan pada fase
kronis dengan menggunakan sampel urin.
 Leptospira dapat dideteksi pada sampel darah bila penderita sedang mengalami
fase bakterimia atau leptospiremia, dimana bakteri Leptospira beredar di
darah.
 Fase ini berlangsung selama 10 hari (rentang waktu antara dua sampai 20
hari) sejak bakteri masuk dalam tubuh penderita. Pada fase tersebut bakteri
Leptospira akan bermultiplikasi di dalam darah dan kemudian menyebar ke
berbagai organ.
 Kasus yang positif PCR dari sampel darahnya menunjukkan bahwa kasus
sedang mengalami fase bakterimia yang kisaran waktunya tidak lebih dari 10 hari
sejak bakteri masuk ke dalam tubuh.
• Deteksi Leptospira pada urin menggunakan metode PCR merupakan salah
satu upaya yang tepat untuk penemuan kasus sejak dini

• Deteksi penyakit leptospirosis menggunakan metode PCR bukan

berdasarkan keberadaan antibodi tetapi berdasarkan keberadaan bakteri
secara langsung dan dapat mendeteksi keberadaan bakteri leptospira secara
lebih sensitif dan juga lebih cepat.

• Hasil PCR pada penelitian ini dapat mendeteksi DNA Leptospira spesifik
spesies patogen.
• Penderita leptospirosis yang terkonfirmasi dengan metode PCR dari sampel
darah menunjukkan gejala klinis berupa sakit kepala dan demam

• Demam merupakan gejala dominan yang dialami penderita leptospirosis.

• Hasil penelitian Dewi, 2010, menunjukkan 86,7% penderita positif Leptotek

menderita gejala klinis utama yaitu demam.

• sebaiknya pengambilan sampel darah dilakukan saat penderita mengalami

fase demam sehingga kemungkinan penemuan positif penderita dengan
metode PCR menjadi lebih banyak
 Leptotek yang digunakan dalam penelitian ini mampu mendeteksi
keberadaan antibodi anti Leptospira baik dari kelas IgM maupun IgG.

 IgM mulai muncul pada masa awal sakit dan mencapai level yang dapat
dideteksi pada kisaran satu minggu pertama

 Penggunaan Leptotek lateral flow hanya efektif untuk melihat seroprevalensi

leptospirosis di suatu area, namun kurang efektif untuk deteksi di awal waktu
sakit
~Kesimpulan~
Deteksi dini Leptospirosis menggunakan
Leptotek lateral flow menunjukkan
sensitivitas rendah. Pemeriksaan sampel
darah dan urin menggunakan metode
PCR dapat mendukung upaya penemuan
kasus sejak dini.