Anda di halaman 1dari 45

KLONING DAN

REKOMBINASI
DNA
Oleh :

Defitiana Wanita 15030234018


Noerman Yusuf P. P. 15030234032
Farid Abdur Rohman 15030234044
REKOMBINASI DAN
KLONING GEN
Pengertian Rekombinasi Genetik

Rekombinasi genetik adalah proses pertukaran


elemen genetik yang dapat terjadi antara
untaian DNA yang berlainan (interstrand), atau
antara bagian-bagian gen yang terletak dalam
satu untaian DNA (intrastrand).
Dalam pengertian yang lebih sederhana,
rekombinasi genetik didefinisikan menjadi
penggabungan gen dari satu atau lebih sel ke sel
target. Sel yang disisipi atau dimasuki gen dari
luar atau dari sel lain disebut biakan rekombinan.
Pengertian Kloning Gen

Klon disebut sebagai


salinan identik. Klon sel
merupakan sekelompok sel
yang identik sifat-sifat
genetiknya, semua berasal
dari datu sel; sedangkan
klon gen atau kloning
molekular adalah
sekelompok salinan gen
yang bersifat identik yang
direplikasi dari satu gen
yang dimasukkan ke Gambar 1. Ilustrasi skematik kloning DNA.
dalam sel inang. (Sumber: Anonim, 2017)
Teknik Kloning

◦ Kloning DNA Rekombinan


Prinsipnya yaitu memindahkan sebagian rantai DNA
yang diinginkan dari suatu organisme pada satu
element replikasi genetik. Misalnya, penyisihan DNA
plasmid bakteri untuk mengklon satu gen.
◦ Kloning Reproduktif
Prinsip kloning reproduktif yaitu menghasilkan
hewan yang identik dengan sel donor. Misalnya,
kloning pada domba Dolly melalui proses SCNT
(Somatic Cell Nuklear Transfer).
◦ Kloning Terapeutik
Teknik ini dilakukan untuk memproduksi embrio
manusia yang nantinya akan dijadikan bahan
penelitian dalam menilai perkembangan manusia
serta penyembuhan penyakit.
Teknik kloning menganut metode yang sama yaitu
transfer inti sel somatik. Hanya saja, dalam
pengaplikasian metode tersebut terdapat dua teknik
yang berbeda. Berikut ini penjelasan dua teknik yang
dimaksudkan tersebut:
◦ Teknik Roslin
Teknik Roslin merupakan teknik pengkloningan yang
dikembangkan di Roslin Institute. Percobaan yang
dilakukan yaitu membuat boneka dengan
mengadaptasi pada teknik kloning
◦ Teknik Honolulu
Teknik Honolulu dikembangkan di University of
Hawaii oleh Dr. Teruhiko Wakayana. Prinsip Dr.
Wakayana yakni menghapus inti dari sel somatik
yang kemudian dimasukkan ke dalam telur yang
intinya telah dihapus.
Kloning DNA Rekombinan

Kloning DNA rekombinan prinsipnya


yaitu memindahkan sebagian rantai
DNA yang diinginkan dari suatu
organisme pada satu element
replikasi genetik. Misalnya, penyisihan
DNA plasmid bakteri untuk mengklon
satu gen.
Kloning Reproduktif

Prinsip kloning reproduktif yaitu


menghasilkan hewan yang identik
dengan sel donor. Misalnya, kloning
pada domba Dolly melalui proses
SCNT (Somatic Cell Nuklear
Transfer).
Kloning Terapeutik

Kloning terapeutik merupakan teknik


kloning yang tujuannya berbeda
dengan dua jenis kloning
sebelumnya. Teknik ini dilakukan
bukan untuk menghasilkan spesies
baru, tetapi untuk memproduksi
embrio manusia yang nantinya akan
dijadikan bahan penelitian dalam
menilai perkembangan manusia
serta penyembuhan penyakit.
2 TUJUAN KLONING GEN
Tujuan Kloning Gen

1. Ilmu Pengetahuan
2. Mengembangkan dan
Memperbanyak Bibit Unggul
3. Tujuan Diagnostik dan Terapi
4. Mengatasi Infertilitas
5. Bidang Ekonomi
3 KOMPONEN KLONING GEN
Komponen Rekombinasi dan Kloning
Gen

a. Gen Target
b. Gen Vektor
c. Enzim Restriksi
d. Enzim Ligase
e. Sel Inang
Gen Target

Merupakan fragmen DNA (gen) yang


akan dikloning, digunakan sebagai
gen yang akan diperbanyak. DNA
target bisa diperoleh dengan du
acara, yaitu:
◦ Produk PCR
◦ Fragmen DNA hasil pemotongan
dengan enzim restriksi
DNA Vektor

Vektor merupakan suatu molekul DNA sirkular


yang bertindak sebagai wadah untuk
membawa DNA target masuk ke dalam sel
inang dan bertanggungjawab atas
replikasinya. Syarat suatu vektor adalah:
◦ Dapat dipotong dengan enzim restriksi
◦ Mampu memasuki sel inang
◦ Bereplikasi sendiri (memiliki ori / Original of
Replication)
◦ Menghasilkan jumlah copy yang banyak
◦ Mempunyai ukuran yang relative kecil (< 10
kb)
Plasmid

Merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk


sirkular dan terdapat bebas di dalam sel. Plasmid
dapat bereplikasi sendiri di dalam sel inang
karena mempunyai suatu urutan DNA spesifik
yang disebut ori / titik awal replikasi. Plasmid
memiliki ciri-ciri antara lain:
◦ Berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya
ganda (double stranded)
◦ Dapat melakukan replikasi sendiri di luar
kromosom inti
◦ Terdapat di luar kromosom
◦ Secara genetic dapat ditransfer secara stabil
Enzim Restriksi

Enzim restriksi merupakan suatu endonuklease


yang mengenal urutan spesifik pada molekul
DNA dan berfungsi untuk memotong-motong
benang DNA yang panjang menjadi pendek agar
dapat disambung-sambungkan kembali
Tabel. Enzim restriksi yang umum digunakan

Recognition
Enzyme Source Cut
Sequence
EcoRI Escherichia coli 5’GAATTC 5’--G AATTC--3’
3’CTTAAG 3’--CTTAA G--5’

EcoRII Escherichia coli 5’CCWGG 5’-- CCWGG--3’


3’GGWCC 3’--GGWCC --5’

BamHI Bacillus 5’GGATCC 5’--G GATCC--3’


amyloliquefaciens 3’CCTAGG 3’--CCTAG G--5’

HindIII Haemophilus 5’AAGCTT 5’--A AGCTT--3’


influenzae 3’TTCGAA 3’--TTCGA A--5’

TaqI Thermus 5’TCGA 5’--T CGA--3’


aquaticus 3’AGCT 3’--AGC T--5’
Enzim Ligase

Enzim ligase merupakan enzim yang digunakan


untuk menyambung DNA dengan cara
mengkatalisis reaksi pembentukan kembali
ikatan fosfodiester antara potongan fragmen
DNA atau RNA berujung kohesif yang saling
berkomplemen (hasil pemotongan dengan enzim
restriksi).
Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA
ligase dari E. coli, DNA ligase dari Fage T4, ligase
bakteri termofilik, dan termostable DNA ligase.
Sel Target

◦ Sel inang merupakan organisme yang


menampung virus, dll yang umumnya dengan
menyediakan makanan dan tempat
berlindung. Sel ini berfungsi dalam
menyimpan den atau fragmen DNA yang
sudah diklon.
◦ Sel inang yang biasa digunakan dalam
rekombinasi DNA adalah sel bakteri
Escherichia coli.
PROSES REKOMBINASI DAN
4
KLONING GEN
Proses Rekombinasi dan Kloning Gen

1. Isolasi DNA
2. Restriksi Plasmid
3. Ligasi Molekul- molekul DNA
4. Transformasi Sel Inang
5. Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan
6. Sekuensing Fragmen Gen
Isolasi DNA

◦ Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau


pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan
baik dengan cara mekanis seperti sonikasi,
tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara
enzimatis seperti pemberian lisozim.
◦ Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-
bahan sel yang relatif lunak dapat dengan
mudah diresuspensi di dalam medium bufer
nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih
kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang
kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium
dodesil sulfat (SDS).
Restriksi Plasmid

Tahap kedua dalam kloning gen adalah


pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun
plasmid. Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan
enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke
dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim
restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim tersebut dari
bakteri Haemophilus influenzaestrain Rd, dan sejak
saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe
II dari berbagai spesies dan strain bakteri.
Restriksi Plasmid

Gambar 2. Peta restriksi pTP510 dan pHIS1525.


(Sumber: Sumarsih dkk, 2011)
Restriksi Plasmid

(Sumber: Sumarsih dkk, 2011)

Gambar 3. Analisis produk PCR (amplikon) dengan elektroforesis gel


agarosa 1% : pTP = plasmid pTP510 (DNA cetakan); M = DNA
penanda; X = amplikon gen xyl sebelum pemurnian; X’ dan X” =
amplikon gen xyl setelah pemurnian.
Ligasi Molekul- molekul DNA

Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi


fragmen-fragmen DNA secarain vitro.
◦ Ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri.
◦ Ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. Coli
yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau
lazim disebut sebagai enzim T4 ligase.
◦ Pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk
menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan
untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung
lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi
menggunakan DNA ligase.
Transformasi Sel Inang

Tahap berikutnya adalah analisis terhadap hasil


pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta
analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut
menggunakan teknik elektroforesis. Jika hasil
elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen
DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA
vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan,
campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang
agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan
sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain
terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah
fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak
terligasi satu sama lain.
Transformasi Sel Inang

Tahap-tahap transformasi :
Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel bakteri
membengkak dan membentuk sferoplas yang
kehilangan protein periplasmiknya sehingga
dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan
ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks
resisten DNAse dengan ion-ion Ca2+ yang terikat
pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian
diambil oleh sel selama perlakuan panas diberikan.
Transformasi Sel Inang

(Sumber: Sumarsih dkk, 2011)

Gambar 4. Proses restriksi dan rekombinasi DNA target


yang kemudian dilakukan transformasi ke dalam sel
inang.
Seleksi Transforman dan Seleksi
Rekombinan

Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat


terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu
1. Sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau
berarti transformasi gagal,
2. Sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti
ligasi gagal, dan
3. Sel inang dimasuki vektor rekombinan
dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang
diinginkan.
Seleksi Transforman dan Seleksi
Rekombinan

Seleksi sel rekombinan dilakukan dengan mencari


fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak
(probe). Pelacakan fragmen yang diinginkan dapat
dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi
koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke
membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan
protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa
DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan
perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA
yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan
dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate).
Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel
rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.
Seleksi Transforman dan Seleksi
Rekombinan

(Sumber: Sumarsih dkk, 2011)

Gambar 5. Analisis DNA plasmid rekombinan dengan


elektroforesis gel agarosa 1% : pHIS = vektor pHIS1525;
nomor 1-10 = DNA plasmid dari transforman 1-10.
Seleksi Transforman dan Seleksi
Rekombinan

(Sumber: Sumarsih dkk, 2011)

Gambar 6. Analisis plasmid rekombinan E1 dengan


elektroforesis agarosa 1% : A = uncut plasmid; B = hasil
pemotongan ganda plasmid E1 dengan Sacl/Sphl; C =
amplikon gen xyl; pHIS = plasmid pHIS1525; M = DNA penanda
DNA λ / HindIII (fermentas).
Sekuensing Fragmen Gen

Tahapan sekuensing dilakukan untuk mengetahui


sekuen fragmen gen yang terinsersi ke dalam
vektor. Untuk mengetahui struktur gen sisipan
dalam plasmid rekombinan dan tingkat
homologinya terhadap gen target, maka dilakukan
sekuensing dengan primer walking. Urutan sekuen
sebagai berikut: start → signal peptide (SPlipA) →
gen target → His-tag → stop.

Gambar 7. Urutan sekuen saat dilakukan sekuensing.


(Sumber: Sumarsih dkk, 2011)
(Sumber: Sumarsih dkk, 2011)
Gambar 7. Sekuen yang didapatkan dalam tahap sekuensing.
(Sumber: Sumarsih dkk, 2011)
Gambar 8. Peta restriksi pSMX (mempunyai sekuen yang sama
dengan sekuen gen penyandi β-xilosidase asal G. thermoleovorans
IT-08 (nomor akses DQ345777), dengan tingkat homologi sebesar
99,93%).
5 DAMPAK KLONING GEN
Dampak Kloning Gen

Dampak Positif
◦ Teknik kloning merupakan alternatif untuk melestarikan
hewan langka sehingga keberadaan hewan langka
dapat terus dipertahankan.
◦ Teknik kloning membantu meningkatkan ketersediaan
bahan pangan yang lebih banyak dengan melakukan
klonning pada hewan ternak.
◦ Teknik kloning berperan dalam menghasilkan sel,
jaringan, atau organ yang sesuai untuk pengobatan
akibat kelainan atau gangguan suatu fungsi organ.
◦ Teknik kloning membantu menumbuhkan spesies baru
yang bebas penyakit keturunan.
◦ Teknik kloning sangat berperan terhadap kemajuan
bidang sains.
Dampak Kloning Gen

Dampak Negatif
◦ Penyalahgunaan teknik kloning seperti
menciptakan spesies baru yang bertentangan
dengan nilai kemanusiaan.
◦ Individu yang dihasilkan dari teknik kloning
sangat rentan terhadap suatu penyakit
dikarenakan teknik kloning menghasilkan individu
yang tidak memiliki sistem imunitas.
◦ Teknik kloning akan menyebabkan spesies yang
dihasilkan bersifat monoton, karena DNA maupun
sifat dan fisik hasil klonning persis sama dengan
induknya.
◦ Individu yang dihasilkan dari teknik kloning
cenderung memiliki masa hidup yang sama
dengan induknya, karena sel-selnya
diperoleh dari induknya.
◦ Teknik kloning belum sempurna masih
terdapat banyak kekurangan, sehingga tak
jarang hewan ternak yang di kloning harus
di eutanasia.
◦ Teknik kloning mengacaukan hubungan
antara individu baru dengan sel induknya.
Kelainan Rekombinasi dan Kloning Gen

Proses pengkloningan manusia merupakan proses


yang rumit karena DNA manusia amat kompleks.
Sulit memetakan DNA manusia, memilih gen yang
baik dan membuang gen yang buruk. Banyak
sekali kegagalan dalam proses pengkloningan
manusia. Hasilnya pun mengerikan. Banyak yang
tidak tahu bahwa risiko terbesar dari makhluk hasil
pengkloningan adalah kelahiran yang cacat dan
tidak sempurna. Selama ini kita tidak pernah
mengetahui betapa mengerikannya bayi-bayi hasil
kloning manusia yang gagal. Inilah bayi-bayi hasil
kloning manusia yang gagal.
Kelainan Rekombinasi dan Kloning Gen

Gambar 9. Contoh kegagalan


kloning pada DNA manusia.
(Sumber: Anonim, 2017)
KESIMPULAN
o Rekombinasi genetik adalah proses pertukaran
elemen genetik yang dapat terjadi antara untaian
DNA yang berlainan (interstrand), atau antara
bagian-bagian gen yang terletak dalam satu
untaian DNA (intrastrand). Kloning merupakan
teknik penggandaan gen yang menghasilkan
turunan organisme yang memiliki sifat sama, baik
dari segi hereditas maupun penampakan dengan
induknya, baik pada tumbuhan, hewan, maupun
manusia.
o Tujuan rekombinasi dan kloning gen yaitu:
menambah ilmu pengetahuan; pengembangan
dan perbanyakan bibit unggul; tujuan diagnostik
dan terapi; mengatasi infertilitas; dan dalam
bidang ekonomi.
o Komponen yang memiliki peran dalam
rekombinasi dan kloning gen tertentu yaitu: gen
target; pembawa gen atau vektor; enzim
pemotong dan penyambung; dan sel target.
o Proses dalam rekombinasi dan kloning gen diawali
dengan isolasi DNA, kemudian restriksi plasmid,
ligasi molekul DNA, transformasi sel inang, seleksi
transforman dan seleksi rekombinan, terakhir
dilakukan sekuensing fragmen DNA.
o Penerapan rekombinasi dan kloning gen dalam
kehidupan sehari-hari dapat menimbulkan dampak
positif maupun dampak negatif.
o Rekombinasi dan kloning gen dapat mengalami
kegagalan ketika dihadapkan pada DNA kompleks
seperti DNA manusia.