Wulan Puspita

1161050214

Pembimbing:
dr. Robert Sirait, SpAn
KEPANITERAAN ILMU ANESTESI
PERIODE 25 JULI 2016 – 27 AGUSTUS 2016
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS KRISTEN INDONESIA
JAKARTA
 HMGB-1 : high mobility group box
 TLR-2 : toll-like receptor-2
 TLR-4 : toll-like receptor-4
 RAGE : receptor for advanced glycation end-products
 CCD : charge-coupled device
 LPS : Lipopolissacharide
 MALP-2 : macrophage-activating lipopeptide 2 kD
 CFDA SE : carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester;
A2 Molecular Probes, Carlsbad, CA
 ELs : circulating endogenous leukocytes
 EPC : Endothelial progenitor cell
 HSC : haematopoietic stem cell
 PCR : polymerase chain reaction real time
Real time
 SVEC : simian virus 40-transformed mouse endothelial cell
 NF-kb : nuclear factor-B activation
 MMP-2 : metalloproteases 2
 MMP-9 : metalloproteases 9
 eNOS : endothelial nitric oxide synthase
 ICAM-1 : Intercellular Adhesion Molecule 1
 VCAM-1 : vascular cell adhesion molecule 1
HMGB-1 (high mobility group box 1) merupakan sinyal
kemo-atraktif yang kuat baik untuk inflamatori maupun
sel-sel punca.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi

mekanisme yang meregulasi adhesi dan pengguliran sel-
sel c-kit+ yang dimediasi oleh HMGB-1 dan menilai/
meneliti apakah toll-like receptor-2 (TLR-2) dan toll-
like receptor-4 (TLR-4) sel-sel endotelial atau sel-sel c-
kit+ terimplikasi pada aktivasi sinyal migrasi yang-
menghilir ke sel-sel c-kit+ tepi.
Pentingnya kemokin dan inflamasi lokal untuk lalu lintas sel
punca terhadap jaringan yang mengalami cedera
HMGB-1, yang juga dikenal sebagai ampthotericin, akan
terkonservasi, dan mengekspresikan protein inti yang
dilepaskan di dalam ruang ekstraselular oleh nekrotik, bukan
oleh sel-sel apoptotik.
HMGB-1 diekspresikan oleh sel-sel setelah aktifasi
inflamatori dan bekerja pada ruang ekstraselular sebagai
kemoatraktan untuk sel-sel inflamatori, sel-sel otot polos
dan sel-sel punca. Reseptor untuk produk akhir glikasi
(RAGE) dan anggota keluarga TLR merupakan reseptor selular
HMGB-1.
Rancangan percobaan
 Semua percobaan pada binatang dilakukan dengan
mengacu pada Pedoman untuk Penanganan dan
Penggunaan Hewan Laboratorium, dan semua
percobaan mendapatkan izin dari komite penggunaan
dan perawatan hewan daerah.
 Tikus tipe liar jantan (C57BL/6J, yang berbobot 20-25 g secara
stokastik dipilih sebagai donor sum-sum tulang untuk percobaan

in vitro in vivo
(n = 10) (n = 50)

sebagai penerima untuk injeksi sel dan analisis

mikroskopis fluoresens intravital (n = 48)

Tikus TLR-2 (-/-) (B6.129- tikus Tlr4 (LPS-del)

Tlr2Tm1kir/j)(n = 12) (C3H/HeJ)(n = 12)

disertakan untuk analisis mikroskopis

fluoresense intravital (m = 60 dan
untuk donasi sum-sum tulang (n = 6)
 Bahan dan metode
Rancangan percobaan

Mikroskopi fluoresens Isolasi dan analisis penapis sel

intravital: perilaku sel c-kit+ c-kit+ yang diaktivasi oleh
pada interface endotelium fluoresen dari sumsum tulang
venular karena stimulus murin/ tikus
HMGB-1

Analisis imunofluoresen motilitas

Analisis PCR waktu-nyata/ β1-integrin, P-selectin dan ICAM-
1 terhadap membran SVEC
langsung kuantitatif
setelah prekondisi HMGB-1

Imunohistokimia

Analisa Statsitik
 Otot kremaster diangkat dan dibagi menjadi dua
bagian untuk analisis hilirsatu potong dimasukan
kedalam formaldehida 4% dan dipasang di parafin
untuk imunohistokimia (n = 5, untuk tiap kelompok).

Setelah deparafinisasi dan pengambilan protein,

potongan jaringan kremaster (tebal 5 µm) diinkubasi
dengan antibodi monoklonal nitrik oksida sintase
endotelial anti-tikus (eNOS) selama satu malam.

 Pada hari kedua, antibodi sekunder anti-wild mouse

terkonjugasi Alexa 488 diaplikasikan pada potongan.
TOPRO 3 (Invitrogen digunakan untuk memberi label
nuklei. Setelah pewarnaan fluorosen, jaringan
dianalisis oleh mikroskop konfokal TCS SPE (Leica
Microsystems).
 Interaksi in vivo sel-sel c-kit+ dengan endotelium paling tinggi terjadi
pada venula pasca-kapiler
 HMGB-1 saja dapat meningkatkan pengguliran sel-sel c-kit+ venular in
vivo
 LPS dan MALP-2 tidak terlalu memberi pengaruh terhadap pengguliran
sel-sel c-kit+
 HMGB-1 meningkatkan adhesi endotelial sel-sel c-kit+ yang melekat in
vivo
 LPS dan MALP-2 memicu adhesi sel-sel c-kit+ dengan tingkat sedang
 HMGB tidaklah memicu perguliran dan pelekatan c-kit tipe liar pada
tikus yang TLR-2 dan TLR-4 nya sudah dimodifikasi
 HMGB memicu pengguliran dan pelekatan kuat sel-sel c-kit+ dari
pemodifikasian TLR-2 dan TLR-4 pada mikrovaskulatur tipe liar
 Peningkatan komponen seluler ekspresi eNos dan c-kit yang dimediasi
oleh HMGB-1 adalah bergantung pada TLR-2
 Ekspresi peningkatan komponen seluler P-selectin yang dimediasi oleh
HMGB-1 bergantung kepada TLR-2
 Respon inflamatori setelah superfusi HMGB-1 dosis rendah pada otot
kremaster
 Stimulasi dengan HMGB-1 untuk memicu polarisasi β-1 integrin, P-
selectin dan ICAM-1 pada sel-sel endotelial tikus
 Gambar 3. HMGB-1 dapat meningkatkan ekspresi eNOS dan c-kit di dalam
keberadaan TLR-2. PCR real time kuantitatif dan analisis mikroskopi konfokal
pengembalian sinyal sel punca pada otot kremaster. (A) Ekspresi gen c-kit dan eNOS
pada kelompok ‘Kendali’, HMGB-1’ ‘TLR-2ko’, dan ‘TLR-4ko’. Tingkat rerata
ekspresi mRNA eNOS dan c-kit di jaringan otot kremaster di kelompok ‘kontrol’
diberikal nilai 1 (*P < 0,05 versus ‘kontrol’, #P < 0,05 versus ‘TLR-2ko’). Gambar
mikroskopik konfokal representatif mengilustrasikan ekspresi pola eNOS yang
berbeda di kelompok ‘HMGB-1’. Sinyal eNOS+ (warna hijau) adalah banyak di lapisan
endotelial (bagian atas) dan terlokalisasi dengan sel-sel hematopietik yang
melekat/ menempel (bagian bawah). Warna merah: TOPRO-3 dalam nukeli.
 Gambar 4. Kadar mRNA P-selectin dengan keberadaan dan
ketiadaan TLR-2 dan TLR-4. Analisis PCR real time di kelompok
‘kotrol’, ‘HMGB-1’, ‘TLR-2ko’, dan ‘TLR-4ko’. mRNA P-selectin
secara signifikan mengalami peningkatan komponen seluler
melalui HMGB-1,
 terjadi hanya ketika TLR-2 bersifat fungsional. Tingkat
ekspresi rata-rata mRNA eNOS dan c-kit pada kremaster
‘Kontrol’ mendapatkan nilai 1 (**P < 0,01 versus ‘Kontrol’).
Gambar 5. Adhesi leukosit endogen
pada otot kremaster 15 menit
setelah superufsi HMGB-1 langsung.
(A) Jumlah leukosit yang melekat
(n/mm2) di kelompok ‘Kontrol’ dan
‘HMGB-1’. (B) Analisis PCR real time
kuantitatif sinyal pro-inflamatori β1-
integrin dan CD45 kelompok
‘Kontrol’, ‘HMGB-1’, ‘TLR-2ko’, dan
‘Tlr-4ko’.
Tingkat ekspresi mRNA rata-rata
β1-integrin, CD45 dan c-kit pada
kremaster ‘kontrol’ diberikan nilai 1
(garis) (*P < 0,05 versus ‘Kontrol’).
Gambar 6. Perubahan-perubahan yang
dipicu oleh HMGB-1 di dalam ekspresi
molekul-molekul adhesi permukaan SVEC.
(A) Pewarnaan imunofluoresen
representatif β1-integri pada SVEC yang
tidak diberi perlakuan, SVEC yang diberi
perlakuan dengan TNF-alfa, SVEC yang
diberi perlakuan dengan SDF-1 alfa, atau
SVEC yang diberi perlakuan dengan
HGMB. (B) Jumlah SVEC yang menunjukan
polarisasi β1-integrin di dalam kelompok.
(C) Gambar repsentatif expresi P-selectin
pada plasmalema SVEC pada sel-sel yang
tidak diberi perlakuan, sel-sel yang diberi
perlakuan dengan TNF-alfa, SDF-1alfa,
atau yang diberi perlakuan dengan HMGB-
1. (D) Jumlah SVEC yang menunjukan
redistribusi P-selectin setelah stimulasi
dengan sitokin yang berbeda-beda. (E)
Gambar konfokal pola ekspresi ICAM-1
terhadap membran SVEC. (F) Kuantitas
sel-sel yang mempresentasikan polarisasi
ICAM-1 setelah prakondisi dengan TNF-
alfa, SDF-1alfa, atau HMGB-1 (*P < 0,05
versus ‘Kendali’, HPF = 630x).
 Tujuan utama penelitian ini adalah untuk
menginvestigasi pengaruh HMGB-1, TLR-2,
dan TLR-4 terhadap fase awal diapedesis dan
transmigrasi sel c-kit+ in vivo.
 berupaya untuk mengkarakterisasi pengaruh
HMGB-1 terhadap ekspresi molekul-molekul
adhesi, yang terlibat di dalam penambatan,
pengguliran, dan adhesi selular pada dinding
vaskular in vivo.
 PrekondisiHMGB-1 otot-otot kremaster tikus
dapat memicu peningkatan pengguliran dan
adhesi c-kit+ yang signifikan in vivo

 merepresentasikan langkah awal untuk

ekstravasasi selular.

 kemokin dapat meregenerasi peningkatan

komponen seluler sinyal-sinyal eNOS dan c-
kit yang drastis pada otot kremaster setelah
proses superfusi.
 Keberadaan reseptor HMGB-1, TLR-2 dan TLR-4
pada sel endotelial vaskular adalah bersifat
wajib untuk afinitas yang ditingkatkan oleh
HMGB-1 antara sel-sel c-kit+ dan lapisan
endotelial.
 Kemudian, TLR-2 penting untuk ekspresi eNOS,
c-kit, dan P-selectin yang dimediasi oleh HMGB-1
pada otot kremaster setelah diberi perlakuan. Di
sisi lain, tidak terdapat perbedaan pengaruh
yang dimediasi HMGB-1 terhadap c-kit+ yang
diisolasi dari hewan TLR-2 (-/-) dan TLR4 (LPS-
del) jika dibandingkan dengan sel-sel kontrol.
Secara In vitro, stimuli HMGB-1 merupakan
determinan untuk pengenalan molekul-molekul
adhesi yang penting pada plasmalema sel-sel
endotelial.
 Kesimpulan

membuktikan bahwa HMGB-1 dapat

 Penelitian
meningkatkan migrasi sel-sel c-kit+ in vivo dan
mengaktivasi sel-sel endotelial baik in vivo
maupun in vitro.

 HMGB-1 terhadap rekruitmen sel punca yang

meningkat untuk regenerasi jaringan dan fungsi
yang penting akan pensinyalannya yang
menghilir melalui TLRs.