Anda di halaman 1dari 35

Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza


Química Farmacéutico Biológica
Laboratorio de Microbiología Farmacéutica

Proyecto 2: Aislamiento de microorganismos


productores de ácidos orgánicos

EQUIPO 3
HERNÁNDEZ MORALES DAVID ISMAEL
NAVA NAVA ANILÚ
SÁNCHEZ CARMONA MAAT XCHEL
SILVA MENDOZA JORGE ENRIQUE
PARRA AGUILAR JULIO CESAR
VELASCO BAZÁN BRENDA JIMENA
Screening

 Es la detección y aislamiento de
microorganismos de interés industrial de entre
una población compleja de organismos
utilizado procedimientos selectivos.

Aislamiento y selección de microorganismos industriales. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017] disponible en:
https://www.researchgate.net/profile/Pedro_Mateos2/publication/261983443_AISLAMIENTO_Y_SELECCION_DE_MICROORGANISMO
S_INDUSTRIALES/links/0c9605360d23d7f2d4000000.pdf?inViewer=0&pdfJsDownload=0&origin=publication_detail
Screening primario

 Detección y aislamiento de microorganismos


potencialmente útiles. Generalmente se parte de
una población mixta (suelo, fermentaciones
naturales, etc.) donde existe tanto una gran
cantidad como variedad de microorganismos
potencialmente útiles que debemos seleccionar.
 Por ello se usan medios selectivos.
 Posteriormente se reaíslan esos microorganismos
que hemos aislado para su posterior estudio.
Aislamiento y selección de microorganismos industriales. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017] disponible en:
https://www.researchgate.net/profile/Pedro_Mateos2/publication/261983443_AISLAMIENTO_Y_SELECCION_DE_MICROORGANISMO
S_INDUSTRIALES/links/0c9605360d23d7f2d4000000.pdf?inViewer=0&pdfJsDownload=0&origin=publication_detail
Screening secundario

 Estudio de los microorganismos aislados en el


screening primario para separar los que tienen
interés potencial de los que tienen interés real y
mejorar estas cepas seleccionadas.

Aislamiento y selección de microorganismos industriales. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017] disponible en:
https://www.researchgate.net/profile/Pedro_Mateos2/publication/261983443_AISLAMIENTO_Y_SELECCION_DE_MICROORGANISMO
S_INDUSTRIALES/links/0c9605360d23d7f2d4000000.pdf?inViewer=0&pdfJsDownload=0&origin=publication_detail
Microorganismos productores de ácido cítrico

Microorganismos productores de ácido cítrico

Mucor piriformis
Aspergillus aureus
Aspergillus clavatus
Aspergillus wentii
Penicillium luteum
Penicilium citrinium
Ustulina bulgaris
Aspergillus niger
Paecelomyces divaricatum
Candida guillermondii
Trichoderma viridae

Sánchez AM. Principios de mircobiologia industrial. Ciudad de México, México: Editorial Química SA; 1961.
Características de los microorganismos para
utilizarse en procesos fermentativos

 Ser genéticamente estable


 Producir células vegetativas
 Esporas u otras formas reproductivas
 Crecer vigorosa y rápidamente después de
inocularse
 Debe ser un cultivo puro
 Producir el producto requerido en poco tiempo
Bouix M. Microbiología Industrial “los microorganismos de interés industrial”. España: Editorial ACRIBIA SA; 2000.
Características de los microorganismos para
utilizarse en procesos fermentativos

 Exclusiones de sustancias tóxicas


 Poseer mecanismos de defensa contra
contaminación
 Ser resistentes a cambios por mutágenos
 Debe permitir una buena conservación del
producto

Bouix M. Microbiología Industrial “los microorganismos de interés industrial”. España: Editorial ACRIBIA SA; 2000.
Características macro y microscópicas de
Aspergillus niger
 Es un género mitospórico, se caracteriza por la
generación de hifas especializadas
denominadas conidióforos, de las cuales se
originan esporas sexuales o conidios
 Posee 3 partes bien diferenciadas como son:
vesicula (extremo apical hinchado), estipe
(sección cilíndrica situada debajo de la
vesícula) y célula pie (sección que une al
micelio con el conidióforo).
Abarca L. “Taxonomía e identificación de especies implicadas en la aspergilosis nosocomial”. AEM. Rev Iberoam Micol; Vol 17: S79-S84.2000
Características macro y microscópicas de
Aspergillus niger
Morfología macroscópica.
 Colonias granulosas
 Aterciopeladas
 Polvosas
 Blancas al principio
 Después café oscuro y negras
 Reverso blanco o anaranjado
Morfología microscópica.
 Conidios lisos y largos
 Vesícula de 50 a 75 micras
 Conidios radiales
 Redondos y lisos
Abarca L. “Taxonomía e identificación de especies implicadas en la aspergilosis nosocomial”. AEM. Rev Iberoam Micol; Vol 17: S79-S84.2000
Características macro y microscópicas del
género Penicillium
 Poseen hifas septadas hialinas (1.5-5 µm de diámetro), con
conidióforos simples o ramificadas, métulas, fialides y conidias.
 Las fialides en la punta de los conidióforos es típica llamadas
penicilli (pincel).
 Las conidias (2.5-5 µm de diámetro) son redondas, unicelulares y
observadas como cadenas no ramificadas en el extremo de las
filaides.

Abarca L. “Taxonomía e identificación de especies implicadas en la aspergilosis nosocomial”. AEM. Rev Iberoam Micol; Vol 17: S79-S84.2000
Características macro y microscópicas del
género Penicillium
Morfología macroscópica
 Tamaño ilimitado, ocupa todo el medio de
cultivo
 Color verde con un halo blanquecino
 Forma y aspecto plana, polvosa,
aterciopelada
 Morfología microscópica
 Micelio macrosifonado
 Microconidios entre 1 y 3 μm

Abarca L. “Taxonomía e identificación de especies implicadas en la aspergilosis nosocomial”. AEM. Rev Iberoam Micol; Vol 17: S79-S84.2000
Características macro y microscópicas de
Aspergillus niger y género Penicillium

Microorganismo Características Usos

Aspergillus niger Conidióforo: globoso, Producción de: ácido cítrico,


esterígmas típicamente en dos glucónico, gálico, oxálico,
series, paredes delgadas, no proteasas, amilasas y
ornamentadas, son de color aspergilina.
negro.
Esclerotes globosos:
superficiales, no todas las cepas
lo producen
Penicillium sp Verticilados simétricos ; colonias Produce ácido cítrico y
amarillas, anaranjadas o rojizas, glucónico.
“pinceles” pequeños en un solo
verticilo; conidios elípticos o
globosos.

Sánchez AM. Principios de mircobiologia industrial. Ciudad de México, México: Editorial Química SA; 1961.
Fuentes de obtención de microorganismos
para procesos fermentativos industriales

El éxito del aislamiento y selección de un


microorganismos depende de la fuente utilizada
para su obtención y el método elegido.
 Naturales
 Colección de cultivos

Microbiología industrial. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017] disponible en:


http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/favela/Microbiologia_Industrial_Libro.pdf
Fuentes naturales

 Fermentaciones naturales: vino, pan, queso, materiales


en descomposición
 Animales y plantas enfermos: vacunas
 Suelo (gran variedad y cantidad)

Microbiología industrial. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017] disponible en:


http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/favela/Microbiologia_Industrial_Libro.pdf
Colección de cultivos

 De gran valor comercial, empleadas por la industria


que las posee
 Microorganismos modificados a través de:
Técnicas clásicas de mutación.
Ingeniería genética.
 Aislamiento de nuevos productos metabólicos
 Aislamiento de cepas a partir de ambientes extremos
 Protegidos por patentes
Mateos GPF. Aislamientos y selección de microorganismos industriales. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017]
disponible en: http://www.science.oas.org/simbio/mbio_ind/cap3_mi.pdf
Colección de cultivos
Nombre Abreviatura Lugar donde se encuentra

Australian Collection of ACAM Australia


Antartic Microorganisms
American Type Culture ATCC Rockville, EUA
Collection
Belgian Coordinated BCCM Belgica
Collections of
Microorganisms
Centraalbureau voor CBS Holanda
Schimmelcultures
The Culture Collection of CCAP Reino Unido
Algae and Protozoa
Culture Collection of Fungi CCF República Checa

Czech Collection of CCM República Checa


Microorganisms

Criterios para asegurar la trazabilidad y calidad de los cultivos microbianos de referencia. [Material en línea][Consultado el 25
de febrero de 2017] disponible en: https://www.inti.gob.ar/incalin/pdf/tesis/GladysMastromonaco.pdf
Colección de cultivos
Nombre Abreviatura Lugar donde se encuentra

Centre de Collection de CCTM Lille, Francia


Type Microbial
Culture Collection, University CCUG Suecia
of Göteborg
Culture Collection Network CCN EUA

Collection del ‘Institut CIP Francia


Pasteur
Deutsche Sammlung von DSM Gottingen, Alemania
Mikroorganismen
Institute for Fermentation IFO Osaka

Japanese Federation of JFCC Japón


Culture Collection of
Microorganisms

Criterios para asegurar la trazabilidad y calidad de los cultivos microbianos de referencia. [Material en línea][Consultado el 25
de febrero de 2017] disponible en: https://www.inti.gob.ar/incalin/pdf/tesis/GladysMastromonaco.pdf
Principales técnicas de aislamiento y
selección de microorganismos de la
naturaleza

 Diluciones seriadas:

Medición del crecimiento microbiano. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017] disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_19837.pdf
Principales técnicas de aislamiento y
selección de microorganismos de la
naturaleza

 Diluciones seriadas: en el recuento de hongos filamentosos,


el número de diluciones a realizar depende de si queremos
conocer la flora del alimento respecto al parámetro que
estemos analizando, en cuyo caso dependerá del número
de microorganismos que se espera encontrar, cuanto
mayor sea el número de microorganismos que esperamos
más diluciones decimales deben hacerse del alimento.

Recuento de hongos filamentosos y levaduras. [Material en línea][Consultado el 26 de febrero de 2017] disponible en:
http://coli.usal.es/web/demo_alteracion/RtoHongosLev/RtoHongosLev.html
Principales técnicas de aislamiento y
selección de microorganismos de la
naturaleza

 Aislamiento por agotamiento: se funde el medio de cultivo,


se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa
previamente esterilizada se toma material de un cultivo
heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio
formando estrías.

Métodos de siembra. [Material en línea][Consultado el 25 de febrero de 2017] disponible en:


http://metodosdsiembras.blogspot.mx/
Principales técnicas de aislamiento y
selección de microorganismos de la
naturaleza

 Extendido en placa:

Medición del crecimiento microbiano. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017] disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_19837.pdf
Principales técnicas de aislamiento y
selección de microorganismos de la
naturaleza

 Vaciado en placa:

Medición del crecimiento microbiano. [Material en línea][Consultado el 21 de febrero de 2017] disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_19837.pdf
Principales técnicas de aislamiento y
selección de microorganismos de la
naturaleza

 Características fisiológicas de los


microorganismos:
 Temperatura: Bacillus, coliformes fecales
 Oxígeno: Bacillus sp, Clostridium sp
 Osmolaridad: (cloruro de sodio)
Staphylococcus sp
Principales técnicas de aislamiento y
selección de microorganismos de la
naturaleza

 Agar enriquecido: son medios a los que se agregan un


nutriente extra, pueden ser solidos o líquidos, en estos medios
no crece mejor un determinado grupo de bacterias, sino
todas, en general se utilizan para microorganismos exigentes
por ejemplo, el agar sangre, agar suero, caldo infusión
cerebro-corazón, caldo triptona de soya.

Vullo D, Wachsman M. Microbiología en práctica. Buenos Aires, Argentina: Editorial Atlante SRL; 2000.
Siembra en medios de cultivo selectivos
para hongos

 Agar Sabouraud Dextrosa: el bajo pH del medio resulta


favorable para el crecimiento de los hongos y ligeramente
inhibitorio para las bacterias. En caso de requerirse un
incremento en la inhibición del crecimiento de bacterias, se
recomienda añadir agentes antimicrobianos como la
gentamicina que inhibe el crecimiento de los
microorganismos gram negativos o el cloramfenicol que tiene
un amplio espectro de acción.

Agar Sabouraud Dextrosa. [Material en línea][Consultado el 25 de febrero de 2017] disponible en:


http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_AgarSabouraudDextrosa.pdf
Siembra en medios de cultivo selectivos
para hongos

 Agar PDA: En este medio de cultivo ciertos hongos como


Neurospora, Mucor y Rhizopus crecen rápidamente y en
enmascaran el desarrollo de otros hongos más lentos. Para
eliminar bacterias se le añade al medio justo antes de vaciar
a las cajas Petri, 3 mL de HCl 1% por cada medio litro. Si se
utiliza PDA para recuperar hongos provenientes de plantas se
debe reducir la concentración de papa y dextrosa a 50-75% y
añadir antibióticos.

Preparación de medios de cultivo. [Material en línea][Consultado el 25 de febrero de 2017] disponible en:


http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/16986/Anexo.pdf
Uso de inhibidores
ÁCIDOS ORGÁNICOS
 La actividad antimicrobiana de un ácido orgánico o de su éster se debe a las moléculas
no disociadas de este compuesto, porque esta forma molecular es la más soluble en las
membranas celulares, por esto sólo los ácidos orgánicos lipofílicos tienen actividad
antimicrobiana.
 Estos compuesto inhiben el crecimiento de los microorganismos o los matan por interferir
con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento del
transporte de substratos y el transporte de electrones de la forforilación oxidativa. Como
consecuencia de esto las bacterias no pueden obtener energía y mueren.
 La mayorías de los ácidos orgánicos resultan poco eficaces como inhibidores del
crecimiento bacteriano a los pH de 5.5 a 5.8, y son más eficaces a altas concentraciones y
pH más bajos. (Cuando el estado disociado del ácido es más infrecuente). Su empleo más
frecuente es como micostáticos.
 De todos los ácidos el más efectivo es el acético.

Microbiología de los alimentos. Tema 9 Factores que afectan la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. [Material en
línea][Consultado el 25 de febrero de 2017] http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/09-
factores%20de%20supervivencia.htm
Ejemplos de inhibidores

Ejemplo Medio de cultivo


Antibióticos
Estreptomicina Agar Martin
Colorantes
Fucsina básica Agar ENDO
Sales
NaCl 7.5 % Agar S-110

Microbiología de los alimentos. Tema 9 Factores que afectan la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. [Material en
línea][Consultado el 25 de febrero de 2017] http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/09-
factores%20de%20supervivencia.htm
Función de los componentes de los
medios a utilizar

MEDIO MARTIN

COMPONENTE FUNCIÓN

Glucosa Fuente de carbono y energía

Peptona Fuente de nitrógeno, fósforo y azufre.

Fosfato de potasio monobásico Macronutriente (Formar ADN y fosfolípidos) y


regulador de pH.
Sulfato de magnesio Micronutriente (Cofactor de enzimas)

Estreptomicina Inhibidor de bacterias Ajustar a pH 6


Esterilizar a 15 lb
Agua destilada por 15 min.

MEDIOS DE CULTIVO. [Material en línea][Consultado el 25 de febrero de 2017] Disponiblle en: http://www.ugr.es/~pomif/pom-


bac/pb-i/pb-i-2-concepto.htm [Última consulta: 25/02/2017] DIBICO. Agar Green-M. Medio de Cultivo; Bacteriología General.
Catálogo 1090. [Última consulta: 25/02/2017]
Función de los componentes de los
medios a utilizar
MEDIO FOSTER

COMPONENTE FUNCIÓN

Glucosa Fuente de carbono y energía

Peptona Fuente de nitrógeno, fósforo y azufre

Fosfato de potasio monobásico Macronutriente (Formar ADN y fosfolípidos) y


regulador de pH.
Sulfato de magnesio Micronutriente (Cofactor de enzimas)

Agar bacteriológico Agente solidificante


Ajustar a pH 6
Verde de bromocresol Indicador de pH (verde -> amarillo) Esterilizar a 15 lb
Agua destilada por 15 min.

MEDIOS DE CULTIVO. [Material en línea][Consultado el 25 de febrero de 2017] Disponiblle en: http://www.ugr.es/~pomif/pom-


bac/pb-i/pb-i-2-concepto.htm [Última consulta: 25/02/2017] DIBICO. Agar Green-M. Medio de Cultivo; Bacteriología General.
Catálogo 1090. [Última consulta: 25/02/2017]
Objetivo

 Aislar hongos a partir de muestras de suelo o


de frutas contaminadas usando las técnicas de
dilución y extendido en placa.
 De los hongos aislados seleccionar los más
adecuados con base a la cantidad producida
de ácidos orgánicos.
Material

 Cajas de Petri
 Pipetas graduadas de 1,5 y 10mL
 Tubos de ensaye con agua o solución salina estéril
 Asa bacteriológica
 Matraces Erlenmeyer de 500 y 1000mL
 Agujas de disección
 Microorganismos: cepas de hongos aislados de muestras
de suelo o frutas contaminadas (preferentemente de los
géneros Aspergillus niger o Penicillium sp).
Método

Tomar una muestra  Colocar en un Hacer diluciones


de suelo o fruta tubo de ensaye hasta obtener una
contaminada con 5mL de concentración
solución salina 10−5

A partir del tercer dia


De las dos ultimas Extender observar el
Agregar en el
diluciones tomar uniformemente e crecimiento cada 24hr
medio de Martin
0.2-0.5mL incubar a 29 °C hasta la aparición del
A. niger
Método

Tomar una porción de


 Refrigerar caja la colonia e inocule
positivas positivas por punción en el
centro de la caja con
medio de Foster

Realizar un frotis y Incubar a 29°C y


teñirlo con azul de observar
algodón-lactofenol crecimiento
Método

En el medio de Colocar una gota


Foster seleccionar Tinción con azul de azul de
colonias con un de algodón algodón en un
halo amarillo portaobjetos

Describir las
Tomar una muestra
características Observar al
de cultivo y
macroscópicas y microscopio a 10X
colocarla en la
microscópicas de los y 40X
gota
hongos aislados

Medir el diámetro
de los halos
amarillos en el
medio Foster