Inmovilización de enzimas
Curso Posgrado 2012
No hay agregación
No hay interacciones con interfases
No hay posibilidad de proteolisis
-
- - - ---
-
-
-
- -
+ + + +
No es necesario bloquear
INMOVILIZACIÓN REVERSIBLE SOBRE
SOPORTES RÍGIDOS RECUBIERTOS DE POLÍMEROS POLIFUNCIONALES
Curso Posgrado 2012
NH3+
-
COO
SO4-2
Gran concentración de grupos: adsorción fuerte
100
Actividad desorbida, %
100
Suspensión 75
75
Actividad, %
50
50
25
25
Sobrenadante
0
0
0 200 400 600 800 1000
0 1 2 3 4 5
[NaCl] (mM)
Tiempo (min)
100
75 Sepabeads-PEI
Actividad remanente, (%)
DEAE
50
25
Enzima soluble
Tª 55º C
0 pH 7
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)
His
- His
COO
+2
Me His
COO
- His His
His
His
His
Enzimas naturales
His
+ + +
RIGIDIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D
+
ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS POR
Curso Posgrado 2012
INMOVILIZACIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL
ESTABILIZACIÓN 3-D
Bucle inestable
Curso Posgrado 2012
GRUPOS AMINO
¨
NH Muy reactivo cuando está ionizado
2
Mayoritariamente en la superficie
Abundante
+
NH3
¨ 2
NH +
NH3
+
-OH NH3
+
NH3
Reactividad mayor en el amino más reactivo (pk 7,5 <<< 10.7 (lys)
Muy difícil rigidificar la superficie a pH alcalino
GRUPOS MUY POCO REACTIVOS
Curso Posgrado 2012
+
NaBH4
Bases de Schiff muy inestables
..
- NH2 (muy buen nucleófilo sin necesidad de activación)
O O
NH 2
N N O OH
H H2
NH3+
NH3+
NH2
NH3
NH3
O O
N O N
H2 H
INMOVILIZACION DE ENZIMAS
A TRAVÉS DE SUS GRUPOS AMINO
Curso Posgrado 2012
+ NH +
NH3
3
H2N R’
+ H2N R
H2N
O
O CH2 C + H2N R
H
LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS
Y SOPORTES GLIOXIL
Curso Posgrado 2012
NH2 NH2
H2N
H2N
H2N
H2N
pH 8.0 (NO)
pH 10.0 (NO)
NH2
H2N
Regiones muy ricas
H2N en grupos aminos
H2N
H2N
pH 10.0 (SI)
EL PROCESO DE MULTI-INTERACCIÓN
ENZIMA - SOPORTE
Curso Posgrado 2012
.........
O
O CH2 C O CH2 CH2OH
H
CH N O CH2 CH2 NH
O CH2
NaBH4
O CH2 CH N O CH2 CH2 NH
1mg/ml
O CH2 CH N
O CH2 CH2 NH
O
O CH2 C O CH2 CH2OH
H
LOS GRUPOS GLIOXIL: SOPORTE-O- CH2 - CHO
O ..
O CH2 C NH2
H
Modificación química mínima
+ +
E NH3 E NH2 CH2 CH2 O
O
O
C
C
O H
H
C O O
H
C C
O
H H
C O
H
C
H
>>>
estable
Curso Posgrado 2012
Hipótesis multiméricas:
NH2
NH2
NH2
pH 8
Si hubiera varios aminos terminales en un mismo plano de la proteína esta se podría inmovilizar
multipuntualmente sobre glioxil a pH 7-8
Ésta inmovilización debería involucrar a muchas subunidades
Curso Posgrado 2012
LOS SOPORTES EPÓXIDO PARA LA UNIÓN COVALENTE
MULTIPUNTUAL.
Curso Posgrado 2012
NH2
O SH
H2N
O
OH
O
O
NH2 NH2
O
Grupos estables
Posibilidad de reacción con muchos residuos de la enzima
Brazos espaciadores cortos
Muchos grupos activados
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS SOBRE SOPORTES EPÓXIDO
O O
O
NH2
NH2
O ..
..
..
..
O NH2
NH2
O O
Reacción amino-epoxido :
Intermolecular muy lenta
Intramolecular muy rápida e intensa
MECANISMO DE INMOVILIZACIÓN-ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS A
SOPORTES EPÓXIDO
Curso Posgrado 2012
O
O
O NH3+
O
NH3+
NH3+ pH 7.0 NH3+
+
NH3 .. O NH3+ ..
O
NH2 Adsorción NH2
O
O
física
pH 7.0
.. O
NH2
O
NH3+
pH 10 NH3+
O NH3+
Interacción Inmovilización
multipuntual covalente
OH O
NH 3+
+
H 2N
OH
O COO-
+
NH
COO-
COO- O
NH 2
NH2 H 2N +
COO-
O
COO- O
+ OH
1) H 2N B
COO- OH
O
2) Me+2 OH
O
+
NH2 H2N
OH O
COO-
+2
NH+ Me
B
O COO-
HO OH
SOPORTE
Eupergit
Eupergit Cu+2 Eupergit boronato Eupergit – NH3+
Hidrofóbico*
Proteína
inmovilizada
70% >85% 75% 65%
Condiciones: pH 7 y 25ºC
* 1 M de fosfato sódico
PGA E. coli 75 nd 75
-galactosidasa A.oryzae 0 95 0
-galactosidasa 40 35 95
Thermus.sp.T2
Epóxido hidrolasa A.niger 30 95 0
100 Boronato-Epóxido
80 M+2-Epóxido
Actividad, (%)
60
40
20 NH2-Epóxido
0
Hidrófobico - Epóxido
Soluble
0 20 40 60
pH 6,5; 70ºC
Tiempo (horas)
O
+
O
+
O
O +
+
O
O
+
+
O 2,5 0,25 +
INMOVILIZACION COVALENTE
O 2 0,2
0,5 0,05
O 0 0
0 20 40 60 80 100 +
% EPOXIDOS MODIFICADOS
Suficientes grupos nuevos para favorecer la adsorción y muchos grupos epóxido fácilmente
accesibles para favorecer la inmovilización covalente.
TERCERA GENERACIÓN DE SOPORTES EPÓXIDOS
O HO
O
+ +
+ NH2
NH2 NH2
- NH2 NH2 -
pH 7 pH 7
-
HO -
O +
O
NH2 NH2 NH2
+ +
NH2 NH2
Incubación
a pH 10
BOLSILLO HODROFÓBICO
- -
- -
- - ZONA RICA EN HISTIDINAS
- -
++
++ ++
++
- -
- -
++
++
CUARTA GENERACIÓN DE SOPORTES EPÓXIDO:INTERCAMBIADORES TIOL-DISULFURO
O O
pH 7
S S R SH S S
O O
Incubación
a pH 10
Grupos reactivos
NaOH
NaIO4
INMOVILIZACIÓN EN TRES PASOS
NH3+
pH 7.0
NH3+
NH3+
¨ 2
NH Incubación a pH 7
Incubación a pH 10
NH3+
NH3+
NH3+
¨ 2
NH
Inmovilización covalente
multipuntual muy intensa Inmovilización covalente
intramolecular suave
Curso Posgrado 2012
BTL2 inmovilizada en aminos sin groups glioxil (■); BTL2 inmovilizada en soportes
amino-glyoxyl a pH 8 durante 12 h (▲); BTL2 inmovilizada en amino-glioxil a pH 8
e incubada durante 3 horas a pH 10 (♦).
Table 3: Immobilization of BTL on different glyoxyl supports.
Ionizado amino-glioxil pH 7 + baja fuerza iónica Región con mayor carga negativa neta
Ionizado carboxi-glioxil pH 7 + baja fuerza iónica Región con mayor carga neta positiva
Curso Posgrado 2012 Activation of agarose gels with epiclorhydrine : glyceril-epoxy supports
Long-term incubation at pH 7.0: mild intramolecular covalent immobilization with glyoxyl groups
CLECs CLEAs
Entrecruzante
Ventajas:
Inconvenientes:
precipitante
PEG
sales, disolventes
Agente
entrecruzante
CLEAs
Curso Posgrado 2012
No necesario
soporte
CLEAs
Co-agregación
enzimas-polímeros Estabilización
Effect of dilution on the thermal stability of
CLEA from M. lysodeiktycus catalase
Curso Posgrado 2012
100
60 Clea1/10
Clea1/100
soluble1/10
40 soluble1/200
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 Las condiciones experimentales
fueron: 60ºC , pH 7,
Tiempo (h) 10000 IU/ml
Entrecruzamiento
Agregación
0,8
0,6
e/eo
0,4
0,2
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Time(hours)
CLEA G PVA
1,2
0,8
e/eo
0,6
0,4
0,2
0
0 100 200 300 400
Time(hours)
100
Actividad, %
75
50
25
0
0 20 Tiempo, (h)
40
Estabilización de enzimas:
(multiméricas, disolventes, O2, etc)