Basic Of Molecular Cloning

Syahruni Hidayatullah
Definis Kloning
 Kloning berasal dari kata Yunani kuno “Clone” yaitu
cangkok atau terubus
 Kloning merupakan suatu upaya tindakan untuk
memproduksi atau menggandakan sejumlah individu yang
hasilnya secara genetik identik berasal dari induk yang
sama, mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang sama.
 Kloning merupakan teknik penggandaan gen yang
menghasilkan turunan sifat yang sama baik segi heriditas
maupun penampakannya dengan induknya, pada
organisme, baik tumbuhan, hewan maupun manusia
Sejarah Kloning Gen

• Herbert Webber, Muncul suatu istilah untuk sekelompok

mahluk hidup yang dilahirkan tanpa proses seksual dari suatu
1903 induk

• Bricks and Yount, Melakukan penyelidikan tentang kloning

terhadap katak dengan cara memasukkan nukleus yang
1952 sedang mengalami proses pemisahan ke dalam sel normal

• Wilmut and Champbell, Melakukan kloning pada domba

finn dan blacface yang diberi nama “Dolly”
1997
Jenis Kloning
Kloning Individu
 Kloning individu adalah teknik rekayasa genetik yang digunakan
untuk menghasilkan organisme baru dengan kode genetik yang
sama dengan induknya sehingga memiliki sifat identik.
 Tahun 1996, Dr. Ian Wilmut melakukan rekayasa genetik pada
domba “Domba Dolly” yang dihasilkan dengan pembiakan
aseksual (tanpa pertemuan antara ovum dan sperma)
 Sel kelenjar susu (domba finn dorset) sebagai donor inti
difusikan dengan sel telur (domba blackface) sebagai resipien.
Hasil fusi tersebut berkembang menjadi embrio dalam tabung
percobaan yang selanjutnya dipindahkan ke dalam rahim domba
blackface.
Jenis Kloning
Kloning Gen (DNA Rekombinan)
 Teknik Kloning gen / DNA rekombinan adalah teknik rekayasa
genetik yang dilakukan dengan cara penyisipan gen dari suatu
organisme dalam genom organisme lain dengan tujuan agar
organisme target membawa sifat sifat tertentu dari gen yang
disisipkan

 Komponen Kloning :
1. DNA Vector : berfungsi sebagai wadah DNA sisipan
2. Enzim endonuclease restriksi : digunakan untuk memotong DNA
3. Enzim ligase : digunakan untuk menyambung DNA
4. Sel inang : berfungsis untuk menyimpan gen atau fragment DNA yang
sudah di klon
5. DNA sisipan : digunakan sebagai wadah DNA yang akan diperbanyak
Komponen Kloning Gen
DNA Sisipan

Merupakan fragment DNA (gen) yang akan di kloning

DNA sisipan dapat di peroleh dengan 2 cara yaitu :
1. Produk PCR
2. Fragment DNA hasil pemotongan dengan enzime retriksi

Vektor

Vektor merupakan suatu molekul DNA sirkular yang bertindak sebagai wadah
untuk membawa DNA sisipan masuk ke dalam sel inang dan bertanggung jawab
atas replikasinya.
Syarat Vektor :
1. Dapat di potong dengan enzim retriksi
2. Mampu memasuki sel inang
3. Bereplikasi sendiri (memiliki ori )
4. Menghasilkan jumlah copy yang banyak
5. Mempunyai ukuran yang relatif kecil (< 10Kb)
Jenis Vektor yang umum digunakan

1. Plasmid
2. Bakteriofage Lambda
3. Kosmid
4. YACs
Jenis Vektor yang umum digunakan
Plasmid

Merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler (ekstra kromosom) dan
terdapat bebas di dalam sel prokariot

Plasmid dapat bereplikasi sendiri di dalam sel inang karena mempunyai suatu urutan
DNA spesifik yang disebut Ori (original of replication / titik awal replikasi)

Ciri-ciri Plasmid :
1. Molekular DNA sirkuler (ekstra kromosom), terdapat
pada sel prokariot spt. Bakteri
2. Ukuran kecil, sehingga mudah diisolasi dalam keadaan
utuh
3. Memiliki paling tidak satu sekuen/urutan DNA sebagai
titik asal replikasi
4. Membawa satu atau lebih gen spt. Sifat resisten terhadao
tertrasiklin dan antibiotik
Jenis Vektor yang umum digunakan
Bakteriofag

Merupakan virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang bersifat
litik atau lisogenik, bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor

Kosmid

Merupakan vektor yang di konstruksi dengan menggabungkan kos dan DNA I

dengan plasmid.
Kemampuannya untuk membawa fragment DNA sepanjang 32 – 47 kB

Vector YACs

Yeast Artificial Chromosome / kromosom buatan dari Khamir dikonstruksi dengan menggabungkan
antara DNA plasmid dan segmen tertentu DNA kromosom khamir.
YACs mampu membawa fragment DNA genomic sepanjang lebih dari 1 MB
YACs dapat digunakan untuk mengklon gen utuh manusia, misalnya gen penyanding cystic
fibrosis yang panjangnya 250 Kb.
YACs digunakan pada proyek genom manusia
Komponen Kloning Gen
Enzim Restriksi

Enzim restriksi merupakan suatu endonuclease yang mengenal urutan spesifik

pada molekul DNA dan memotong pada urutan yang spesifik
Komponen Kloning Gen
Enzim Ligase

Enzim yang akan mengkatalisis reaksi pembentukan kembali ikatan

fosfodiester antara potongan fragment DNA atau RNA berujung kohesif
yang saling berkomplemen hasil pemotongan dengan enzim retriksi
Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E.Coli, DNA
ligase dari Fage T4, ligase bakteri termofolik dan termostabel DNA
lgae

Sel Inang

Organisme yang menampung virus, dll umumnya dengan

menyediakan tempan dan tempat berlindung.
Misalnya E.Coli Competent
Mekanisme Kloning DNA
Mekanisme Kloning Gen :
1. Isolasi Gen (DNA) yang diinginkan
2. Pemotongan DNA dengan enzim endonuclease
restriksi
3. Penyisipan / penyambungan DNA ke dalam vektor
dengan bantuan enzim ligase
4. DNA rekombinan di masukkan ke dalam bakteri
5. Seleksi dan peningkatan ekpresi gen terkloning
Tahap-tahap Kloning Gen
Isolasi DNA
 Isolasi DNA yang diawali
dengan melakukan perusakan
serta penghilangan dinding sel
yang di lanjutkan dengan
pelisisan.

Pemotongan/ fragmentasi DNA

 Dilakukan dengan menggunakan

enzim restriksi enonuklease.
Pemutusan ini di lakukan di dalam
strain tertentu yang bertujuan untuk
mencegah agar tidak merusak DNA
Penyambungan / Ligasi DNA
 Ligasi bertujuan untuk melekatkan/menyambung potongan-potongan
DNA dalam sekuen yang diinginkan
 Fragment DNA di campur dengan vektor (plasmid) yang telah
dipotong dengan enzim retriksi yang sama
 Terdapat beberapa cara dengan cara penyambungan dengan
menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri, serta dengan
pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk mensintesis
untai tunggal homopilimerik 3’
Transformasi sel--- Proses dimana DNA akan dimasukkan
kedalam sel inang
 Transformasi dapat dilakukan dengan cara :
1. Heat shock, dimana campuran sel dan DNA plasmid rekombinan
didinginkan dalam waktu yang lama, kemudian di panaskan dengan
segera pada suhu ± 42°C
2. Electroforator (kejutan listrik) menggunakan alat yang dialirkan
arus listrik

Seleksi klon rekombinan

 Seleksi klon rekombinan bertujuan untuk menentukan koloni
mana yang membawa plasmid DNA
 Terdapat beberapa cara seleksi klon rekombinan :
1. Seleksi berdasarkan sifat resistan terhadap antibiotik
2. Seleksi dengan melibatkan gen LacZ
Gambar ligase dan transformasi
 Sel hasil rekombinan di kultur pada media selektive
(Ampicilin + IPTG/isoprofil+B-DTriogalaktopiranosida +
X-Gal)

 Seleksi transformasi di lakukan dengan pengamatan biru

dan putih
 Coloni Putih : sel yang disisipi dengan DNA rekombinan
 Coloni Biru : sel yang tidak disisipi dengan DNA rekombinan

 Mekanisme coloni berwarna putih dan biru?