VALIDASI METODE UJI

Perancangan Sistem Penjaminan Mutu dan

Sistem Manajemen Laboratorium Kimia
 Preface
KIMIA

ANALISIS

VALIDASI
Nilai
Sebenarnya
(absah)
 Definisi
Badan POM RI (Anonim, 2006)
”Tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai
bahwa tiap bahan, proses, prosedur, kegiatan,
sistem, perlengkapan atau mekanisme yang
digunakan dalam produksi maupun pengawasan
mutu akan senantiasa mencapai hasil yang
diinginkan.” (CPOB: 2006)
AOAC (2002:5)
Validasi adalah proses yang menunjukkan atau
membuktikan karakteristik kinerja metode suatu
analisis dapat diterima atau tidak.

ISO/IEC klausul 5.4.5.1, mengartikan validasi sebagai ”Langkah

Konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif
bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus telah
dipenuhi”
 Parameter Validasi Metode
1. Linieritas
2. Batas Deteksi (LOD)
3. Batas Kuantitasi (LOQ)
4. Ketelitian (Presisi)
5. Ketepatan (Akurasi)
6. Selektivitas
7. Sensitivitas
8. Uji Ketegaran (robustness)
9. Uji Ketangguhan (ruggedness)
10. Ketidakpastian (uncertainty)
 Kapankah suatu metode harus divalidasi

 Metode tidak baku, misalnya dari diktat, textbook dan jurnal

yang belum diakui secara luas.
 Metode yang didesain/dikembangkan oleh laboratorium
untuk keperluan sendiri yang merupakan suatu kegiatan yang
terencana dan ditugaskan kepada personil yang cakap,
dilengkapi dengan sumber daya yang memadai.
 Perubahan sekecil apapun dari metode standar, misalnya
perubahan prosedur dan perubahan volume reagensia.
 Metode rutin digunakan di laboratorium yang berbeda, atau
dilakukan oleh analis yang berbeda atau dilakukan dengan
peralatan yang berbeda.
 Gabungan dari dua atau lebih metode standar.
 Linearitas
 Menunjukkan kemampuan suatu metode analisis
memberikan respon yang secara langsung atau
dengan bantuan transformasi matematik yang baik,
proporsional terhadap konsentrasi analit dalam
sampel.

 Ditentukan dengan cara membuat kurva kalibrasi

dari beberapa set larutan standar yang telah diketahui
konsentrasinya (minimal 5 larutan deret standar)
 Kurva Kalibrasi Persamaan Garis R

Koefisien korelasi (R) inilah yang digunakan untuk mengetahui

linearitas suatu metode analisis.
Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah :
>/= 0,9970 (ICH 1995 International Conference on
Harmonisation)
>/= 0,9980 (WAWestern Austrlia Laboratory
Operations Manager)
>/= 0,9980 (AOAC)
1. Dibuat 7 buah larutan standar (2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5;
15,0;17,5 ppm).
2. Dilakukan pengukuran absorbansi untuk setiap konsentrasi
standar pada kondisi optimum.
3. Dibuat persamaan garisnya dengan metode regresi liniear y
= ax + b (a = kemiringan garis, b = intersep).
4. Linieritas kurva kalibrasi dilihat dari nilai koefisien korelasi
(r).
5. Pekerjaan dilakukan sebanyak 3x ulangan.
 1.0000
y = 0.0655x + 0.0389
0.8000 R² = 0.9990
Absorbansi

0.6000

0.4000

0.2000

0.0000
0 5 10 15
Konsentrasi (ppm)
 Sensitivitas
 Menunjukkan kemampuan dari suatu alat atau
prosedur penentuan untuk membedakan perbedaan
kecil dari konsentrasi analit
 Dilihat dari harga Slope persamaan regresi kurva
standar
 Nilai kemiringan garis yang kecil menunjukkan bahwa
perubahan konsentrasi yang kecil tidak terlalu
berpengaruh terhadap sinyal detektor yang dihasilkan,
sehingga metode mempunyai sensitivitas yang kurang
baik
LOD dan LOQ
LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel
yang dapat dideteksi yang masih memberikan
respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Jika
blanko tidak menghasilkan sinyal, sehingga standar
deviasi dari 10 pembacaan terhadap blanko yang
sama adalah nol, maka LOD diukur menggunakan
dengan standar.
LOQ adalah konsentrasi terendah analit yang dapat
ditentukan dengan akurasi yang bisa diterima.
 Penentuan LOD & LOQ
Terdapat 3 cara penentuan LOD dan LOQ
1. Metode S/N (instrumental analysis)
puncak ke puncak kebisingan di sekitar waktu retensi analit
diukur, dan kemudian, konsentrasi analit yang akan
menghasilkan sinyal sama dengan nilai tertentu dari
kebisingan untuk sinyal rasio diperkirakan

Noise besarnya dapat diukur secara manual pada printout

kromatogram atau dengan autointegrator dari instrument.

Sebuah sinyal-to-noise ratio (S/N) dari tiga umumnya

diterima untuk memperkirakan LOD dan rasio signal-to-
noise dari sepuluh digunakan untuk LOQ.
2. Penentuan blanko
Penentuan blanko diterapkan ketika analisis blanko memberikan
hasil standar deviasi tidak nol. LOD dinyatakan sebagai
konsentrasi analit yang sesuai dengan nilai blanko sampel
ditambah tiga standar deviasi dan LOQ adalah konsentrasi analit
yang sesuai dengan nilai blanko sampel ditambah sepuluh
standar deviasi seperti yang ditunjukkan dalam persamaan
berikut:
 LOD = x + 3Sb
 LOQ = x + 10 Sb
Dimana x adalah konsentrasi rata-rata blanko dan Sb
adalah standar deviasi dari blanko
3. Kurva kalibrasi
Untuk kurva kalibrasi linear, diasumsikan bahwa respon
instrumen y berhubungan linier dengan konsentrasi x standar
untuk rentang yang terbatas konsentrasi. Hal ini dapat
dinyatakan dalam model seperti :
y = bx + a.
Model ini digunakan untuk menghitung sensitivitas b dan LOD
dan LOQ
Oleh karena itu LOD dan LOQ dapat dinyatakan
sebagai:
LOD = 3Sa/b
LOQ = 10 Sa/b
Sa adalah standar deviasi dan b slope
Hasil Uji LOD dan LOQ metode 3
 Presisi

Presisi didefinisikan sebagai kedekatan hasil yang diterima (baik

sebagai nilai teoretis maupun sebagai nilai rujukan yang diterima)
dengan nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran .
Presisi dinyatakan dengan 2 cara, yaitu:
1. Uji Ketahanan (repeatability)
2. Uji ketertiruan (reproducibility)
 Penentuan Presisi
1. Larutan sampel yang telah disiapkan diukur dengan AAS sebanyak 7
kali ulangan.

2. Ketelitian diukur dengan menghitung persentase relatif standar

deviasi (%RSD) dengan terlebih dahulu menentukan standar deviasi
berdasarkan data hasil percobaan yang diperoleh.
Hasil Uji Ketelitian (Presisi)
 Akurasi
Akurasi menunjukan derajat kedekatan hasil dari sederet
pengukuran yang diperoleh dari contoh yang homogen pada kondisi
tertentu.
Akurasi ini menandakan suatu metode baik dilakukan untuk analaisis
ini, jika akurasinya baik berarti prosedur ini baik.

Ada 3 cara dalam metode ujinya, yaitu:

1. Uji Pungut Ulang (Recovery Test)
2. Uji relatif terhadap akurasi metode baku
3. Uji terhadap standard reference material (SRM)
 Penentuan Akurasi
1. Dilakukan dengan membuat lautan sampel sebanyak 7
buah dan ditambahkan masing-masing kedalamnya
larutan SRM kalsium 15 ppm sebanyak 1 mL.
2. Diukur masing-masing larutan dengan SSA.
3. Dihitung persen perolehan kembali (%recovery) dengan
rumus:

dengan :
= Konsentrasi total sampel yang ditambah analit.
= Konsentrasi sampel sebenarnya
= Konsentrasi analit yang ditambahkan
Hasil Uji Ketepatan (Akurasi)
Selektivitas atau Spesifisitas
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah
kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara
cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali
dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias)
metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan
yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis,
senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis
sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan.
a. Untuk identifikasi
Metode harus mampu menyeleksi senyawa-senyawa
yang ada dalam sampel yang berkaitan dengan
struktur molekulnya. Dapat dibuktikan dengan hasil
positif (atau dibandingkan dengan bahan acuan
standar yang diketahui) dari sampel yang mengandung
analit dan digabung dengan hasil negatif dari
sampel yang tidak mengandung analit.
b. Untuk penetapan cemaran
Dilakukan dengan menguji sampel yang
ditambahkan sejumlah tertentu cemaran atau hasil
urai dan terlihat dengan nyata cemaran itu dapat
ditetapkan secara akurat dan presisi yang memadai
Jika cemaran tidak tersedia maka sampel yang diuji harus diperlakukan
sebelumnya dengan menyimpan sampel dalam kondisi “stress” yang
relevan (cahaya, panas, kelembaban, hidrolisis asam/basa oksidasi).
Dalam kasus ini pengujian dilakukan bersama sampel utuh.

Degradasi yang dimaksud Kondisi Degradasi

- Hidrolisis asam 24 jam dalam HCl 1 N

- Hidrolisis basa 24 jam dalam NaOH 1 N
- Oksidasi 24 jam dalam larutan H2O2 10%
- Pemanasan 24 jam dalam oven 105oC
- Fotodegradasi 1 jam disinari lampu UV (200 – 300 nm)
- Kelembaban 24 jam dalam climatic chamber kelembaban 86%
 Penentuan Selektivitas
1. Dilakukan dengan membuat lautan sampel sebanyak 7 buah
dan ditambahkan masing-masing kedalamnya larutan standar
Mg 1 ppm sebanyak 50 µL.
2. Diukur masing-masing larutan dengan AAS.
3. Dibandingkan hasil perolehan kadarnya dengan uji- t dengan
rumus:
t=
dengan :
t = besaran dalam perhitungan batas kepercayaan dan uji keberartian rataan.
= rataan selisih antar terok
n= jumlah terok
=simpangan baku dari selisih antar terok
 Hasil Uji Selektivitas

Pada batas ketangguhan 95% pada daerah pengujian berikut

kriteria penerimaan : t hitumg 2,45
Daerah kriteria penolakan : t hitumg 2,45
t hitung < t tabel, sehingga dinyatakan dipertahankan dan tidak ada perbedaan
kadar kalsium pada sampel yang ditambah Mg dengan yang ditambah Mg.
sehingga selektivitas metode dinyatakan baik.
 Uji Ketangguhan (Ruggedness)

Uji Ketangguhan (Ruggedness) adalah parameter uji

derajat etertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis
sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal
seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi,
suhu, dan hari yang berbeda.

Dilakukan untuk mengetahui perubahan reliabilitas metode

uji dengan berjalannya waktu rentannya metode uji
terhadap adanya perubahan kondisi pengujian.
 Penentuan Uji Ketangguhan
(Ruggedness)
1. Dilakukan dengan mengukur larutan standar
sebanyak 5 buah dengan 3 kali waktu
pengukuran yang berbeda.
2. Diukur masing-masing larutan dengan AAS.
3. Dibandingkan hasil perolehan kadarnya dengan
uji- F.
4. Uji ketangguhan ini sebagai uji pembanding untuk
metode sebelumnya, jika dilakukan uji ketegaran
ini maka tidak perlu dilakukan pembandingan
metode.
 Hasil Uji Ketangguhan(Ruggedness)

Dari tabel F nilai gawat F adalah 6,944 (P=0,05), karena nilai hasil
hitungan F(=4,200) lebih kecil daripada 6,944, maka hipotesis nol
diterima rataan terok sama secara berarti.
ROBUSTNESS (UJI KEKUATAN)
Robustness adalah ukuran bagi suatu metode analisis
dalam mempertahankan unjuk kerjanya dalam situasi
dimana pengaturan kondisi analisis tidak sesempurna
seperti yang ditetapkan dalam metode yang bersangkutan.
Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang
dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah.