Anda di halaman 1dari 32

Analisis karoten

Karoten

 konsumsi pewarna sintetik menurun dan permintaan


pewarna natural meningkat

 PEWARNA ALAMI, provitamin A , ANTIOKSIDAN


 Secara teori, trans-b-carotene memiliki aktivitas 100%
vitamin A, sementara trans-a-carotene memiliki
aktivitas 50% vitamin A
 Wortel merupakan salah satu sumber terbaik β-
carotene.
 Kandungan karoten pada wortel berkisar 60 – 120
mg/100 g, namun beberapa varietas mengandung 300
mg/100 g
STRUCTURE
CAROTEN

 Karotenoid memiliki struktur aliphatik panjang, dengan


ikatan rangkap terkonjugasi yang disebut polyene
 Struktur terdiri dari hidrokarbon yang tersusun atas 8
unit isoprene dengan rumus molekul C40H64
 Analisis pada sampel biologis dengan matrik kompleks
dan kandungan analit yang kecil, pengujian yang sensitif
dan proses pemisahan yang baik diperlukan
 Seringkali analit dapat terpengaruh selama proses
analisis
Metode

 Karoten diekstraksi terutama dengan 2 metode yaitu


ekstraksi menggunakan pelarut_ traditional solvent
extraction (TSE) dan supercritical fluid extraction (SFE)
 TSE multiple steps, memerlukan pelarut organik dan
produk ekstrak mengandung residu solven
 SFE supercritical CO2 (SC-CO2) extraction, memberikan
metode ekstraksi dengan mengurangi potensi oksidasi
karotenoid
 Temperatur CO2 yang rendah menguntungkan untuk
karotenoid yang labil terhadap pengaruh panas
Karakteristik karotenoid
 Karotenoid adalah pigmen lipofilik (lipochromes atau chromolipids )
 Hidropobisitas dan kelarutannya pada lemak memiliki konsekuensi
yakni :
 memiliki pengaruh yang kuat pada pendekatan pengumpulan
sampel dan pretreatmen
 ketidaklarutan pada air dan kelarutannya yang tidak baik pada
beberapa pelarut organik menjadi pertimbangan metode
ekstraksi dan pre konsentrasi agents
 Karotenoid menunjukkan sifat yang sensitif terhadap cahaya
dan panas.
 Iradiasi dan peningkatan temperatur akan menyebabkan
isomerisasi trans-cis menyebabkan perubahan struktur molekul
asli dan menyebabkan pemecahan molekul, khususnya dengan
adanya udara dan katalis
Lanjut…

 Dengan adanya sistem struktur yang panjang, ikatan


rangkap terkonjugasi, karotenoid memiliki warna yang
intensif dan terabsorbsi pada cahaya tampak antara 400
dan 500 nm
 Makin panjang molekul, makin kuat absorpsi cahaya dan
makin tinggi panjang gelombang absorbsi
 Ikatan rangkap terkonjugasi pada karotenoid tidak
hanya menyebabkan aktivitas spektral tetapi juga sifat
electroactivity nya. Hal ini memberikan kemungkinan
analisis lebih lanjut, terutama untuk deteksi
kromatografi.
Ekstraksi solvent
 Karotenoid larut pada pelarut non polar layaknya lemak minyak
 Karena karotenoid liposoluble, biasanya diekstrak dari tanaman
menggunakan pelarut organik seperti kloroform, heksan, aseton,
petroleum eter
 Sampel dapat mengandung sejumlah air, pelarut organik yang
immisible air seperti etanol juga digunakan
 Permasalahan : eliminasi residu pelarut untuk memperoleh ekstrak
yang aman---solvent food grade etanol
 Calvo et al. (2007) menyatakan bahwa ekstraksi karoten dari
bubuk kulit tomat lebih baik menggunakan etanol dibanding etil
asetat
 2 propanol; ekstraksi β-carotene lebih tinggi dibanding dengan etanol
 Skala industri menggunakan 2-propanol sebagai pelarut pada 60°C
(direkomendasikan suhu 40 – 60 °C)
 Perlakuan pembekuan atau penyimpanan dingin pada wortel
berpengaruh positif, waktu yang diperlukan untuk ekstraksi tergantung
pada perlakuan untuk sample dan juga temperatur yang digunakan
(rata-rata 2-4 jam)
 Disamping diperoleh konsentrat karotenoid, juga ada by product serat
pangan dengan kapasitas pengikatan air yang baik untuk digunakan
sebagai pangan fungsional
Konstanta
Solvents Rumus kimia Titik didih Massa jenis
Dielektrik

Pelarut Non-Polar

CH3-CH2-CH2-CH2-
Heksana 69 °C 2.0 0.655 g/ml
CH2-CH3

Benzena C6H6 80 °C 2.3 0.879 g/ml

Toluena C6H5-CH3 111 °C 2.4 0.867 g/ml

Dietil eter CH3CH2-O-CH2-CH3 35 °C 4.3 0.713 g/ml

Kloroform CHCl3 61 °C 4.8 1.498 g/ml

CH3-C(=O)-O-CH2- Pelarut Polar Aprotic


Etil asetat 77 °C 6.0 0.894 g/ml
CH3
/-CH2-CH2-O-CH2-
1,4-Dioksana 101 °C 2.3 1.033 g/ml
CH2-O-\
Tetrahidrofuran /-CH2-CH2-O-CH2-
66 °C 7.5 0.886 g/ml
(THF) CH2-\
Diklorometana
CH2Cl2 40 °C 9.1 1.326 g/ml
(DCM)
Asetona CH3-C(=O)-CH3 56 °C 21 0.786 g/ml
Asetonitril (MeCN) CH3-C≡N 82 °C 37 0.786 g/ml
Dimetilformamida
H-C(=O)N(CH3)2 153 °C 38 0.944 g/ml
(DMF)
Dimetil sulfoksida
CH3-S(=O)-CH3 189 °C 47 1.092 g/ml
(DMSO)
Pelarut Polar Protic

Asam asetat CH3-C(=O)OH 118 °C 6.2 1.049 g/ml

CH3-CH2-CH2-CH2-
n-Butanol 118 °C 18 0.810 g/ml
OH

Isopropanol (IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 °C 18 0.785 g/ml

n-Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 °C 20 0.803 g/ml

Etanol CH3-CH2-OH 79 °C 30 0.789 g/ml

Metanol CH3-OH 65 °C 33 0.791 g/ml

Asam format H-C(=O)OH 100 °C 58 1.21 g/ml

Air H-O-H 100 °C 80 1.000 g/ml


REMOVAL OF WATER FROM CAROTENOID-CONTAINING
SAMPLES USING A VACUUM OVEN

 Jaringan tanaman mengandung sejumlah air, dan harus dikurangi


untuk memudahkan ekstraksi dengan pelarut organik
 Menggunakan suhu rendah oven vacuum untuk menghilangkan air
dari bahan
 Sampel pada oven vacuum suhu 60°C.
 kondisi vakum antara 305 to 508 mmHg
 Keringkan hingga ∼8% moisture content.
 Overdrying can damage the carotenoids present in the sample.
 Kecilkan ukuran hingga 30 mesh
Lanjut....

 Timbang bahan tanaman, dicampur hingga terbentuk pasta merata


 Tambah 2 bagian etanol 95% untuk dihomogenisasi
 Campur selama 5 menit.
 saring sampel dengan vacuum pada Whatman no. 41 filter paper.
 Jika filtrat keruh ulangi tambah 1 bagian etanol 95%
 Setelah diperoleh filtrat jernih, disimpan -20 C

 Kumpulkan filtrat pada corong pemisah, tambahkan 1 bagian


volume heksan
 Pisahkan bagian bawah dan pekatkan bagian atas yang
mengandung karotenoid (lipofilik) dengan rotary vapor ≤55°C.
simpan ≤24 jam pada−20°C.
Hal yang diperhatikan
 pigments masih mengandung α- and β-carotenes, β-
cryptoxanthin, lutein, zeaxanthin, lycopene,
capsanthin, dan capsorubin, serta lainnya
 Ekstraksi secara industri dilakukan dengan bahan
kering
 Eliminasi air dengan kerusakan pigmen sekecil
mungkin---alternatif pengeringan dengan oven
vacuum
 Pelarut yang digunakan harus sesuai dengan polaritas
pigmen. Jika karakteristiknya tidak diketahui dapat
digunakan acetone/hexane (1:1, v/v).
 Jika diketahui karotenoid terdapat pada sampel,
sifatnya non polar atau dalam bentuk ester, ekstraksi
dengan heksan lebih baik
lanjutan
 Setelah ekstraksi, cara yang paling efisien untuk memulai isolasi
karotenoid dengan cara saponifikasi ekstrak
 Cara saponifikasi akan menghilangkan sebagian besar lipid yang
tidak diinginkan yang ada pada sampel
 By produk saponifikasi yang cukup besar adalah garam sodium
atau potasium, yang akan mudah dipisahkan dengan larutan
aqueous polar
 Penambahan air dapat membantu mencuci kelebihan alkali dan
bahan lain yang larut air serta komponen kompleks-air
 Setelah saponifikasi, pemisahan dengan kromatografi kolom
diperlukan dengan menggunakan pelarut
 Eluen pertama menggunakan pelarut non polar seperti hexane
atau 90:10 (v/v) hexane/acetone untuk mengelusi carotenes and
xanthophyll esters
Contoh pengukuran
Penetapan - karoten metode II (Apriantono. et al., 1996).

Pembuatan Kurva Baku - Karoten


 100 mg β- karoten murni ditimbang dengan teliti, larutkan
hingga tanda batas dalam larutan campuran aseton : n-
heksan (1:9) dalam labu 100 ml hingga didapat konsentrasi
1000 ppm
 lakukan pengenceran 5 variasi kosentrasi 10, 20, 30, 40, 50
ppm, masing-masing kosentrasi tesebut diukur absorbannya
dengan spektrofotometer sinar tampak pada panjang
gelombang 436 nm,
 grafik hubungan dibuat antara absorbansi dengan
konsentrasi β-karoten.
Penetapan kadar karoten
 5–10 g sampel diekstrak dengan campuran 40 mL aseton dan 60 mL
heksana dan 0,1 g magnesium karbonat dalam blender selama 5
menit, saring dengan menggunakan buchner,
 residu dicuci dua kali masing-masing dengan 25 mL aseton,
kemudian cuci lagi dengan 25 mL heksana, seluruh ekstrak yang
diperoleh digabungkan
 aseton dari ekstrak dipisahkan dan ambil/buang dengan pencucian
menggunakan air 5 x 100 mL,
 fasa organik dipindahkan ke dalam labu takar 100 mL yang telah
berisi 9 mL aseton dan encerkan sampai tanda tera dengan
heksana, evaporasi selama 5 menit pada suhu 40 C,
Lanjut…

KROMATOGRAFI
 kolom kromatografi disiapkan dengan adsorben
campuran Magnesia aktif dan supercell (1+1)
setinggi 10 cm, lapisan natrium sulfat anhydrous
ditempatkan setinggi 1 cm di atas lapisan
adsorben,
 ekstrak pigmen hasil evaporasi dimasukkan ke
dalam kolom dengan menggunakan vakum secara
kontinu, elusi dengan menggunakan pelarut aseton
heksana (1:9) sebanyak 50 ml
Lanjut…

 selama operasi jaga supaya lapisan atas selalu


terisi dengan pelarut, karoten akan melewati
kolom secara cepat.
 “Band” (pita) xanthofil, produk oksidasi karoten
dan klorofil akan teradsorpsi dalam kolom,
 hasil elusi dikumpulkan dalam labu 100 ml, sampel
diukur dengan spektrofotometer sinar tampak
pada 436 nm,
 digunakan blangko aseton : heksana (1:9)
 konsentrasi karoten dalam sampel ditentukan
berdasarkan kurva standar yang dibuat.
Tabel data kurva beta
karoten
No ppm Absorbansi
1.200
1.123
1.000
1 10 0.1728 0.908 y = 0.024x - 0.0654
0.800

Absorban
R² = 0.9994
2 20 0.41 0.600 0.657
Linear
0.400 0.410 (Series1)
3 30 0.657 0.200 0.173

4 40 0.908 -
0 20 40 60
konsentrasi
5 50 1.123
Analisis karoten wortel
menggunakan etanol
SAMPLE (CARROT)

 Wortel yang dianalisis setelah panen, setelah disimpan


pada suhu dingin (4–5°C), dan setelah pembekuan(–
18°C) setelah 1 bulan
EXTRACTION

 Wortel diiris kecil lebar 2 mm, panjang 1 cm


 Ekstraksi pada suhu 60°C menggunakan ethanol 96%,
dan 2-propanol.
 25 g potongan wortel ditambah kan ke 100 ml etanol
96%
 Wortel diekstrak pada water bath 60 C, di shaker dan
setiap 10 menit dan setiap jam 5 ml sampel di ambil
dan dicampur dengan petroleum ether (20 ml).
 Air ditambahkan untuk memisahkan fase, pemisahan
fase petroleum-ether-carotenoid hingga volume 50 ml
DETERMINATION OF
CAROTENES
 Kandungan β-carotene pada petroleum ether ekstrak
diukur dengan spektrofotometer

 Absorbansi diukur pada panjang 450 nm menggunakan


spectrophotometer
AOAC methods
SAMPLE PREPARATION

 Wortel dicuci dan diiris menjadi 5 mm pada temperatur


ruang
 Kemudian wortel di freeze dried selama 5 hari untuk
mencapai kadar air 0.8%.
 untuk mencapai ukuran partikel kecil sampel maka
dapat dilakukan grinding sebelum ekstraksi
 Sampel yang sudah disiapkan disimpan pada kemasan
vakum dan memiliki barier terhadap kadar air dan
oksigen, dilabel, dan disimpan pada –18 °C kondisi gelap
TSE was conducted according to the AOAC
Official Method 941.15

 2 gram sampel freeze dried dihomogenisasi dengan


100 hexane/acetone (6:4 v/v) yang mengandung 0.005%
(w/v) BHT.
 Sample di saring dan residu dicuci dengan aseton (2 x 25
ml) dan kemudian dengan 25 ml heksan
 gabungkan flitrat dan kemudian dicuci dengan 3 x 100
aquades.
 Fase organik dikeringkan dengan gas nitrogen
HPLC ANALYSIS
 HPLC analysis of carotenoids was performed using a
Shimadzu chromatograph. Supelcosil TM LC-18 column
(15 cm x 4.6 cm, 5 μm) was used to separate individual
carotenoids at ambient temperature.
 Samples (50 μL) dissolved in methanol/dichloromethane
(1:1 v/v) were injected. Methanol with 10% (v/v)
acetonitrile was used as mobile phase.
 The mobile phase was delivered at a flow rate of 1
mL/min.
 The separated lutein, a-carotene, and b-carotene peaks
were monitored by a UV detector at 450 nm. -
Carotene and lutein standards were used fo
identification and quantification based on a calibration
curve.