Anda di halaman 1dari 47

Analisis Kuantitatif

Vitamin
Presented By
Kelompok I
Edi Gunawan
Moh. Mustari
Nurfiddin Farid
A. Mega Mustika
A. Dhiza Tenri Padang
Muzayyidah
Sri Wahyuni
Tuti Handayani Z.
Vitamin???
• Lat. vita = kehidupan
• Vitamin adalah zat-zat kimia organis dengan
komposisi beraneka-ragam yang dalam jumlah
kecil dibutuhkan olehb tubuh manusia untuk
memelihara metabolism, pertumbuhan dan
pemeliharaan normal.
Penggolongan Vitamin
• Vitamin Larut Air
Vitamin B, C, dan Flavonoid
• Vitamin Larut Lemak
Vitamin A, D, E, dan K
Sifat Fisika Kimia
• Vitamin A (Akseroftol)

Vitamin A tersedia dalam bentuk cair dan padat. Dalam


bentuk cair berupa minyak berwarna kuning muda
sampai merah yang dapat memadat pada pendinginan.
Dalam bentuk padat mempunyai penampilan seperti
pengencer yang ditambahkan; praktis tidak berbau
atau sedikit berbau ikan, tetapi tidak berasa atau
berbau tengik. Tidak stabil terhadap udara dan cahaya.
• Vitamin A didapat dalam 2 bentuk yaitu
preformed vitamin A (vitamin A, retinoid,
retinol, dan derivatnya), dan provitamin A
(karotenoid/karoten dan senyawa sejenis)
yang merupakan prekursor vitamin A.
• Vitamin A atau akseroftol mudah dioksidasi
oleh udara atau oleh senyawa oksidator
lainnya dan peka terhadap sinar, sedangkan
ester vitamin A relatif lebih stabil terhadap
oksidasi.
• Vitamin B
Beberapa diantaranya yaitu vitamin B1, B2, B6, dan B12.
- Vitamin B1 (Tiamin)

Tiamin (vitamin B1) merupakan kompleks molekul organik yang


mengandung satu inti tiazol dan pirimidin.
Tiamin hidroklorida dalam keadaan kering cukup stabil dan pada
pemanasan 1000 C, selama 1 jam tidak berkurang potensinya.
Larutan tiamin hidroklorid dalam air dapat disterilisasi pada 1100C,
akantetapi jika pH larutannya diatas 5,5 akan cepat terhidrolisa.
Satu gram hidroklorida Kristal setara dengan 333,000 Si. Tiamin
monohidrat padat lebih stabil daripada tiamin hidroklorida.
- Vitamin B2 (Riboflavin)

Riboflavin sangat mudah rusak oleh cahaya


tampak dan ultraviolet, akan tetapi tahan
terhadap panas, oksidator, asam, dan
sebaliknya sangat sensitif terhadap basa.
- Vitamin B6 (Piridoksin)

Di alam, vitamin B6 terdapat sebagai campuran


piridoksin, piridoksal, dan piridoksamin
dengan perbandingan yang bervariasi.
- Vitamin B12 (Sianokobalamin)
Molekulnya terdiri atas
bagian-bagian cincin
porfirin dengan suatu
atom Co, basa
dimetilbenzimidazol,
ribosa, dan asam fosfat.
Umumnya senyawa dalam
kelompok ini dinamakan
kobalamin; penambahan gugus-CN pada kobalamin
menghasilkan sianokobalamin, sedangkan penambahan gugus-
OH menghasilkan zat yang dinamakan hidroksokobalamin.
• Vitamin C (Asam Askorbat)
Asam askorbat dalam keadaan
kering cukup stabil, tetapi
dalam larutan cepat dioksidasi
oleh udara. Reaksi oksidasi ini
dipercepat oleh beberapa logam,
terutama tembaga. Asam askorbat
jika terkena sinar lambat laun akan
berubah menjadi cokelat.
• Vitamin D

Vitamin D3 Vitamin D2
Dari beberapa vitamin D, 2 diantaranya dianggap yang
paling penting yaitu vitamin D2 (ergo kalsiferol) dan
vitamin D3 (kolekalsiferol). Struktur kedua vitamin ini
sangat mirip. Vitamin D2 banyak terdapat dalam bahan
nabati, sementara vitamin D3 banyak terdapat dalam
minyak ikan hati.
• Vitamin E (Tokoferol)

Vitamin E adalah bentuk dari alfa tokoferol


(C29H50O2). Termasuk d- atau dl-alfa tokoferol
(C29H50O2); d- atau dl-alfa tokoferol asetat
(C31H52O3); d- atau dl-alfa tokoferol asam
suksinat (C33H54O5).
• Vitamin K
Dikenal 2 jenis vitamin K alam,
yaitu vitamin K1 (filokuinon=
fitonadion) dan vitamin K2
(senyawa menakuinon), dan
1 jenis vitamin K sintetik.
Metode Analisis Kuantitatif
• Vitamin A
- Spektrofotometri
a) Akseroftol dalam bentuk ester
Sampel dimurnikan → timbang →
dilarutkan dalam sikloheksana→ tetapkan
λmaks.
Absorbansi larutan diukur pada panjang
gelombang yang tertera dalam daftar berikut
dan dihitung sebagai absorbansi relatif
terhadap absorbansi pada λ 328 nm.
Absorbansi relatif Panjang gelombang
0,550 300 nm
0,907 316 nm
1,000 328 nm
0,811 340 nm
0,299 360 nm
• Jika panjang gelombang maksimal terletak antara
326 nm dan 329 nm, dan absorbansi relatif yang
terbaca tidak berbeda lebih dari 0,02 dari harga
yang tertera dalam daftar, maka potensi (dalam
SI) tiap zat yang diperiksa dihitung dengan rumus:
A328 x 19.000.
• Jika panjang gelombang absorbansi maksimal
terleetak antara 326 nm dan 329 nm, tetapi
absorbansi relatif yang terbaca berbeda lebih
besar dari 0,02 dari harga yang tertera dalam
daftar, maka dihitung harga absorbansi pada 328
nm yang dikoreksi dengan rumus:
A328 nm (kor) = 3,52 (2A328 nm – A316 nm – A340 nm)
- Akseroftol Lain
Sejumlah zat ditimbang → dicampur dengan 30
mL etanol mutlak dan 3 mL kalium hidroksida
50% → direfluks selama 30 menit sambil
mengalirkan gas nitrogen bebas oksigen ke
dalamnya → didinginkan dengan cepat dan
ditambah 30 mL air → dipindahkan ke dalam
corong pisah → ekstraksi tiga kali, tiap kali
dengan 50 mL eter → digojog selama satu
menit dan dibiarkan memisah → Lapisan eter
dicuci 4 kali, tiap kali dengan 50 mL air →
Sari eter diuapkan (tersisa ± 5ml) → dialiri dengan
nitrogen bebas oksigen hingga sisa eter habis
→ Residu eter dilarutkan dalam isopropanolol →
penentuan λ maks.
• Jika panjang gelombang maksimal terletak
antara 323 nm dan 327 nm dan perbandingan
absorbansi pada 300 nm terhadap absorbansi
pada 327 nm tidak lebih dari 0,73, maka
absorbansi yang telah dikoreksi [A325 nm (kor)]
dihitung dengan rumus:
A325 nm (kor) = 6,815 A325 nm – 2,555 A310 nm –
4,26 A334 nm
Potensi dalam SI tiap zat yang diperiksa
dihitung dengan rumus:
A325 nm (kor) x 18.000
- Kolorimetri
1) Metode Carr-Price
Berdasarkan atas reaksi akseroftol dengan
antimony triklorida anhidrat dalam kloroform yang
menghasilkan warna biru. Pembacaan biasanya dilakukan
dalam waktu 10 sampai 15 detik setelah sampel
ditambah pereaksi.
2) Pengubahan akseroftol menjadi
anhidroakseroftol
1,0 mL larutan sampel dalam benzene + 4 mL
larutan katalisator → setelah 1 menit, dinetralkan dengan
5 mL natrium hidroksida 0,5 N → digojog (1 menit) →
Kedua larutan dipisahkan dengan pemusingan → larutan
jenuh benzene diukur pada 399 nm
3) Kromatografi
Sampel (1,0-10,0 g) dihomogenkan + 30mL
air (sampel padat) → saponifikasi → solute
diencerkan sampai 250 mL dengan air dan
etanol (1:1 v/v) → Sebanyak 20 mL aliquot
ditambahkan ke dalam cartridge Kiselguhr →
setelah 20 menit diekstraksi dengan 50 mL
petroleum eter ringan→ Eluat diuapkan dan
dilarutkan kembali dengan 2-50 mL isooktana
→ dilakukan kromatografi (eluen adalah
heksan yang mengandung l-oktanol dalam
konsentrasi rendah)
• Vitamin B
- Vitamin B1
1) Spektrofluorometri
Tiamin bebas dimurnikan (dialirkan
melalui zeolit) → tiamin dielusi dari zeolit
dengan kalium klorida yang diasamkan
Tiamin dioksidasi oleh kalium
heksasionoferat (III) atau kalium feri
sianida menghasilkan tiokrom, suatu
senyawa yang berfluorosensi biru.
CH3 N NH2

S
OH
N N+ + K3Fe(CN)6
Cl-

CH3
Vitamin B1
CH3 N N
S CH2
OH
CH2
N N

CH3
Tiokrom
2) Kolorimetri
Dasar metode ini adalah reaksi antara tiamin dengan
6-amino-timol yang telah didiazotasi.
Pereaksi 6-aminotimol: melarutkan 50 mg 6-
aminotimol dalam 50 ml asam klorida 0,35% dan
mengencerkannya dengan air secukupnya hingga 100
ml.
Cara kerja : 5,0 pereaksi 6-aminotimol didinginkan
dengan es + 2,0 ml natrium nitrit 0,1% (diamkan 1
menit) + 5,0 ml NaOH20% → diencerkan dengan air
secukupnya sampai 20,0 ml → 1,0 pereaksi + 1,0
larutan sampel → Setelah 5 menit, larutan diencerkan
→ warna yang terjadi disari (90 ml toluene redestilasi
dan 10 ml n-butanol) → Lapisan pelarut organic
dipisahkan + natrium sulfat anhidrat
3. Alkalimetri
500 mg tiamin HCl → dilarutkan dlm air bebas CO2 →
titrasi NaOH 0,1 N
Kadar Tiamin HCL = x 100 %

4. TBA
250 mg tiamin HCl + 10 ml asam asetat glacial + 10 ml
raksa (II) asetat 5% dalam asam asetat glacial+ 20 ml
dioksan → titrasi dengan asam perklorat 0,1 N
menggunakan indicator 3 tetes Kristal violet (biru)
Kadar tiamin HCl = x 100 %
Reaksi:
Cl-.HCl
CH2CH2OH S N CH3

2HClO4
N N
H3C CH2 Hg(CH3COO)2

NH2

CH2CH2OH S N CH3
+ HgCl + 2ClO4-
+ 2CH3COOH
N N
H3C CH2

NH2
5. Argentometri
100 mg tiamin HCl → 100 mg tiamin
hidroklorida + asam nitrat encer
(diasamkan) + 10 ml air perak nitrat 0,1 N
→ Endapan disaring dan dicuci dengan air
sampai tidak mengandung klorida →
Filtrate dititrasi dengan ammonium
tiosianat 0,1 N menggunakan indicator
besi (III) ammonium sulfat
Reaksi :
Cl-.HCl
CH2CH2OH S N CH3

2AgNO3
N N
H3C CH2

NH2

CH2CH2OH S N CH3

+ 2 AgCl + 2HNO3
N N
H3C CH2

NH2

Sisa AgNO3 + NH4CNS → AgCNS + NH4NO3


6 CNS + Fe3+ → Fe(CNS)63-
6. Gravimetri
Tablet ditimbang (setara dengan ±50 mg
tiamin HCl) → diencerkan dengan air
secukupnya hingga 50 ml + 2 ml HCl pekat
→ dipanaskan + 4 ml asam silikowolframat
yang baru disaring lalu dididihkan selama 4
menit (tetes demi tetes) → disaring →
dicuci (1 bagian volume HCl pekat dan 19
bagian air yang mengandung asam
silikowalframat 0,2% b/v) → dicuci 2 kali (5
ml aseton) → Sisa dikeringkan pada suhu
1050C (1 jam)→ didinginkan selama 10 menit
→ dibiarkan dalam eksilator diatas larutan
asam sulfat 38% lalu ditimbang.
- Vitamin B2
1. Metode Spektrofluorometri
• (selama percobaan lautan riboflavin dilindungi terhadap cahaya ).
Kedalam dua tabung dimasukkan masing-masing 10 ml larutan. Pada tabung
kedua ditambah 1 ml larutan riboflavin baku lalu dicampur. Pada tabung
kedua ditambah 1 ml air lalu dicampur. Kedalam masing-masing tabug
ditambah 1 ml asam asetat glacial lalu dicampur.Kedalam kedua tabung
selanjutnya ditambah 0,5 mL larutan Kalium permangaat 4% b/v sambil
diaduk dan dibiarkan selama 2 menit lalu ditambah 0,25 ml hydrogen
peroksida 27,5%. Warna permanganat harus hilang dalam waktu 10 detik.
Kedua tabung dikocok kuat-kuat hingga kelebihan okigen keluar. Jika setelah
pembusahan berhenti ada gelembung gas pada dinding, maka dihilangkan
dengan memiringkan tabung perlahan-lahan. Larutan dalam tabung pertama
selanjunya diukur fluoresensinya (pembacaan A) demikian juga dalam tabug
kedua (pembacaan B ). Pada tabung pertama ditambah 20 mg Natrium
Biosulfit, dicampur, lalu diukur fluoesensinya dan waktu 5 detik setelah
pencampuran.Dilakukan percobaan yang sama dalam tabung kedua
(pembacaan rata-rata kedua tabung adalah pembacaan C).
Kadar (dalam mg riboflavin) dihitung dengan menggunakan rumus;
• Metode Spekrofotometri
Lebih kurang 100 mg riboflavin yang ditimbang
secara seksama dilarutkan dengan pemanasan
dalam campuran ml asam asetat glacial dan 150
mL air. Larutan selanjutnya diencerkan dengan
air, didinginkan, ditambahkan air secukupnya
hingga 1000 ml. Pada 10,0 ml larutan
ditambahkan 3,5 ml natrium asetat 0,1 M
kemudian ditambahkan air secukupnya hingga 10
ml. larutan akhir diukur absorbansinya dengan
kuvet 1 cm pada panjang gelombang 444 nm.
Kadar riboflavin baku sebagai pembanding.
- Vitamin B6
1. Metode Spektrofotometri
Sebanyak 20 tablet ditimbang dan diserbuk.
Pada sejumlah serbuk yang ditimbang saksama
yang setara dengan lebih kurang 25 mg piridoksin
hidroklorida, ditambah 50 ml asam klorida 0,1 N,
sambil sekali-kali diaduk. Larutan diencerkan
dengan asam klorida 0,1 N secukupnya hingga 100
ml. larutan diukur absorbansinya menggunakan
kuvet dengan ketebalan 1cm pada panjang
gelombang maksimum (lebih kurang 291 nm).
Kadar piridoksin hidroklorida dihitung terhadap
piridoksin hidroklorida baku.
2. Metode Kolorimetri
Mendasarkan pada reaksi fenol dengan
2,6-dikloro-p-benzokuin-4-klorimina dengan
menghasilkan warna biru yang dapat disari
dengan pelarut organik.
3. TBA
Lebih kurang 300 mg piridoksin hidroklorida
yang ditimbang saksama, dilarutkan dalam 40
ml asam asetat glasia lalu dititrasi dengan
asam perklorat 0,1 N menggunakan indicator
3 tetes Kristal violet sampai biru hijau. Tiap ml
asam perklorat 0,1 N setara dengan 20,56 mg
piridoksin hidroklorida.
4. Kromatografi
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan detector fluoresen.
Sampel yang telah digerus (2,5 g sampel jika kandungan vitamin B6
lebih besar daripada 2,0 µg/g dan sebanyak 5 g jika kandungan vitamin B6
nya lebih rendah) dicampur dengan 25 ml larutan natrium asetat 0,05 M;
2,5 ml larutan asam glioksalat 1 M; 400 µL larutan besi (II) sulfat (36,56 mg
fero sulfat yang dilarutkan dalam 10 ml natrium asetat 0,05 M); dan 20 mg
fosfase asam. Campuran digoyang terus menerus pada suhu 370C selama
emalam. Setelah selesai inkubasi, campuaran didinginkan dan diencerkan
sampai 50 ml dengan air mendidi lalu disaring atau disentrifugasi.
Sebanyak 5,0 ml aliquot dicampur dengan 4,5 ml larutan natrium
borohidrida 0,1 M lalu digojog dan selanjutnya disaring dan digunakan
untuk analisis dengan KCKT. Pemisahan dilakukan dengan kolom oktadesil
silan (250 x 2,6 µm I,d;ukurn partikel 5 mikron) yang duhubungkan dengan
kolom pengaman oktadesil silan (4 mm x 4 mm i.d; ukuran partikel 10
mikron). Eluen dihantarkan secara isokratik yang tersusun atas :
asetonitril-kalium dihidrogen fosfat 0,05 M (4 : 96 v/v) yang mengandung
natrium heptan sulfonat 0,05 M atau natrium oktan sulfonat 0,03 M; pH
diatur 2,5 dengan asam ortofosfat. Kecepatan alir fase gerak 1 ml/menit
dengan panjang gelombang eksitasi dan emisi detector masing-masing
sebesar 290 dab 396 nm.
- Vitamin B12
1. Metode Spektrofotometri
Lebih kurang 2 mg sianokobalamin yang ditimbang
saksama, dilarutkan dalam air secukupnya hingga 50 ml.
Larutan diukur absorbansinya dengan kuvet 1 cm pada panjang
gelombang 361 nm. Nilai pada 361 nm adalah 207.
2. KCKT
Sianokobalamin diekstraksi dari sampel dengan
mencampur 25 mL susu dengan 2-4 mL HCl 0,1 M pH 4,6.
Campuran dipanaskan pada suhu 120oC selama 10 menit dan
selanjutnya disaring. pH filtrate diatur 5,5 dengan natrium
hidroksida 0,1 M dan diencerkan dengan aquades sampai 50 mL.
Sianokobalamin selanjutnya dipekatkan pada cartridge dan
selanjutnya cartridge dicuci dengan 12 mL air. Sianokobalamin dielusi
dengan asetonitril : air (1:1 v/v) dan dipisahkan dengan kolom oktil
silica. Elusi gradient dimulai dengan asetonitril : larutan ammonium
sulfat pH 3,0 (5:95) lalu konsentrasi asetonitril ditingkatkan sampai
30% selama 16 menit. Konsentrasi vitamin B12 selanjutnya
ditentukan dengan metode radioassay.
- Vitamin C
1) Metode Iodimetri
Lebih kurang 400 mg asam askorbat yang
ditimbang saksama, dilarutkan dalam campuran
yang terdiri atas 100 ml air bebas karbon dioksida
dan 25 mL asam sulfat encer. Larutan dititrasi
segera dengan iodium 0,1 N menggunakan
indikator kanji sampai terbentuk warna biru tetap.
Tiap mL iodium setara dengan 8,806 mg asam
askorbat.
OH OH O OH

HO O
+ I2 + 2HI
O OH
O OH
O
2) Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DCIP)
Diklorofenol-indofenol (DCIP) : melarutkan
50 mg garam Na 2,6-diklorofenol indofenol
yang telah disimpan dalam desikator melalui
“soda lime” dalam 50 mL air yang telah
ditambah 42 mg natrium bikarbonat, lalu
digojog kuat. Jika zat warna telah larut maka
larutan diencerkan dengan 200 mL air lalu
disaring dan dihindarkan dari pengaruh
cahaya dan disimpan dalam refrigerator.
Cara Kerja : sejumlah aliquot sampel yang mengandung
kurang lebih 2 mg asam askorbat. Jika volume aliquot
sampel yang mengandung ± 2 mg asam askorbat < 7
mL, lalu ditambah larutan HPO3—CH3COOH hingga
volumenya 7 mL. Larutan dititrasi secara cepat dengan
larutan DCIP dengan menggunakan buret 50 mL
sampai muncul warna merah muda dalam waktu ≥ 5
detik. Dilakukan replikasi 3 kali titrasi blanko seperti
titrasi sampel dengan banyaknya mL aliquot sampel
diganti dengan mL H2O dalam jumlah yang sama lalu
dihitung volume rata-rata larutan baku DCIP yang
digunakan untuk titrasi blanko.
Perhitungan:
mg asam askorbat/g, tablet, mL =
Reaksi :
OH OH Cl

OH

+ OH N O

O OH
O
Asam askorbat Cl

O Cl
OH

O
+ OH NH HO

O OH
Cl

Asam dehidroaskorbat
3. Metode Kolorimetri 4-metoksi-2-nitroanilin
Perekasi 4-metoksi-2-nitroanilin : melarutkan 500 mg 4-
metoksi-2-nitroanilin dalam 126 mL asam asetat glacial lalu
mengencerkannya dengan asam sulfat 10% sampai 250 mL.
Cara Kerja :
Sebanyak 2 mL pereaksi 4-metoksi-2-nitroanilin ditambah 2 mL
natrium nitrit 0,2%, diaduk hingga warna jingga hilang lalu
ditambah 75 mL n-butil alcohol dan dicampur. Larutan ini
selanjutnya ditambah 0,5-2 mg asam askorbat 0,5% dan
dipindahkan ke dalam corong pisah. Selanjutnya larutan ditambah
25 mL natrium hidroksida 10% dan 150 ml dietil eter, digojog baik-
baik, dan didiamkan hingga memisah. Lapisan bawah (lapisan air)
dipisahkan. Lapisan organic dicuci tiga kali, tiap kali dengan 15 mL
natrium hidroksida 10%. Lapisan air dan cairan hasil cucian dengan
air diencerkan dengan air hingga 200 mL. Blanko dibuat dengan cara
yang sama tanpa penambahan pereaksi. Absorbansi larutan diukur
terhadap blanko pada 570 nm.
4. Metode Spektrofotometri
Asam askorbat dalam larutan air netral menunjukkan absorbansi maksimum pada
264 nm dengan nilai = 579. Panjang gelombang maksimum ini akan bergeser oleh
adanya asam mineral. Asam askorbat dalam asam sulfat 0,01 mempunyai panjang
gelombang maksimal 245 nm dengan nilai = 560.
5. Spektrofluorometri
• Ke dalam labu takar 25 mL, dimasukkan 0,1 ml hydrogen peroksida 1,0 x 10-3
M; 1,5 mL p-kresol 1,0 x 10-3 M; 6,0 mL larutan buffer fosfat pH 10,4 yang
mengandung NH3—NH4Cl 5,0M; sejumlah tertentu sampel yang mengandung
asam askorbat 9x10-10 M dan 0,5 mL hemoglobin 1,0 x 10-5 M. Larutan diencerkan
dengan aquades sampai batas tanda sebelum dilakukan penggoyangan. Larutan
selanjutnya diletakkan di dalam penangas air yang suhunya dijaga tetap pada suhu
25oC selama 10 menit. Intensitas fluoresensi larutan sampel (F) dan blanko (Fo)
diukur pada panjang gelombang eksitasi 318 nm dan panjang gelombang emisi
422 nm. Selanjutnya dihitung selisih nilai F-Fo.
• Metode spektrofluorometri lain untuk analisis kuantitatif vitamin adalah
berdasarkan pada reaksi antara asam askorbat (AA) dengan metilen biru (MB).
Reaksi ini merupakan reaksi redoks, yang mana AA akan dioksidasi menjadi asam
dehidroaskorbat sementara MB akan direduksi menjadi Leuco-MB yang kurang
berwarna.
Reaksi :
OH OH
N
OH

+
N(CH3)2 S N(CH3)2
O OH
O

O H
OH N

O
+
N(CH3)2 S N(CH3)2
O OH
O
6. Metode Kromatografi
Sampel disaring dan diencerkan sebelum
dilakukan analisis dengan KCKT dan tidak ada pra-
perlakuan lain yang dilakukan. Pemisahan asam
askorbat dilakukan dengan menggunakan kolom
oktadesil silan (ODS, C18) menggunakan fase
gerak larutan buffer NaH2PO4-K2HPO4 (pH 6,5).
Aliran fase gerak 0,3 mL/menit. Asam askorbat
yang terelusi dicampur dengan (Ru(bpy)32+ 0,5
mM dan dioksidasi pada 1,5 V (dengan elektroda
Ag/AgCl). Adanya gangguan asam sitrat dapat
dihindari dengan menambah tetrabutilamonium-
tetrafluoroborat (Bu4NBF4) 10-4 M pada eluen.
- Vitamin D
Dalam AOAC, analisis kuantitatif vitamin D dalam
minyak yang mengandung 100.000 SI kolekalsiferol
atau vitamin D3/g, dalam resin yang mengandung
20.000.000 SI kolekalsiferol/gram, dan dalam serbuk
atau disperse cair yang mengandung 25.000 SI
kolekalsiferol/g dilakukan dengan menggunakan
metode kromatografi cair kinerja tinggi dengan kolom
kromatografi Lichrosorb Si 60 (ukuran partikel 5 µm)
menggunakan detetktor UV 254 nm (sensitifitas
detector 0,128 AUFS). Fase gerak : n-heksan : n-amil
alcohol (997: 3 v/v). Kecepatan alir fase gerak 2
mL/menit (1 atmosfer), sementara volume injeksi 20
μl.
- Vitamin E
1. Metode Serimetri
Lebih kurang 250 mg tokoferol asetat yang ditimbang seksama,
dimasukkan ke dalam labu coklat kuning dasar bulat 100 ml
dan dilarutkan dalam 25 mL etanol mutlak. Larutan ditambah
20 mL larutan asam sulfat 15% v/v dalam etanol 95%, lalu
direfluks selama 3 jam dan didinginkan. Larutan dipindahkan ke
dalam labu takar coklat kuning 200 mL dan diencerkan dengan
etanol mutlak secukupnya hingga 200 mL. Sebanyak 50,0 ml
larutan yang diukur secara seksama ditambah 50 ml larutan
asam sulfat 1,5% v/v dalam etanol 95% bdan dalam 20 mL air.
Sambil dicampur baik-baik, larutan dititrasi dengan serium (IV)
sulfat 0,01 N menggunakan indicator 2 tetes difenilamin. Titrasi
dilakukan terlindung dari cahaya langsung, sebaiknya di tempat
gelap, dengan tetesan diatur tiap 10 detik. Dilakukan juga
titrasi blanko. Tiap mL serium (IV) sulfat 0,01 N setara dengan
2,3638 mg tokoferol asetat.
2. Spektrofotometri
Untuk penetapan kadar alfa-tokoferol dalam
etanol digunakan panjang gelombang 292 nm
atau 298 nm dalam sikloheksan. Sementara itu,
untuk alfa-tokoferol asetat panjang gelombang
284 nm dapat digunakan untuk kedua pelarut
tersebut.
3. Metode Kolorimetri
alfa-tokoferol diekstraksi dari sampel dengan
pelarut organik. Residu lemak disabunkan, α-
tokoferol diisolasi dengan kromatografi lapis tipis,
dan ditetapkan kadarnya secara kolorimetri.
- Vitamin K
Cara penetapan kadar dilakukan dengan cara Kromatografi cair
kinerja tinggi.
Suntikkan secara terpisah sejumlah volume sama (lebih kurang 50
µl) Larutan baku dan larutan uji ke dalam kromatograf, ukur respons
puncak utama. Waktu retensi relative baku internal, (Z)-fitonadion
dan (E)-fitonadion berturut-turut lebih kurang 0,7; 0,9; dan 1,0.
Hitung jumlah dalam mg, C31H46O2 dengan rumus :
1,56 C

C adalah kadar Fitonadion BPFI dalam µg per ml larutan baku; Ru


dan Rs berturut-turut adalah perbandingan repons puncak relative
larutan uji dan larutan baku. Hitung Ru dan Rs dengan rumus:
[respons puncak (Z)-fitonadion + respons puncak (E)-fitonadion]
Terima Kasih

Wassalam