djoko priyatno

Hambatan Diagnosa Virus

PEMERIKSAAN VIROLOGIS TIDAK
SERING DILAKUKAN, KARENA:
 Virus yang berukuran 0,02-0,3 µM
tidak bisa diperiksa dibawah
mikroskop cahaya  harus
mikroskop elektron
 Virus lebih sulit dibiakan daripada
kuman / bakteri
 Virus hanya dapat bereplikasi pada
sel host
 Hambatan Diagnosa Virus
 Untuk biakan (invitro) menggunakan
organ-organ hewan atau biakan
jaringan sebagai medium karena
memerlukan sel hidup
 Memerlukan laboratorium khusus
(sarana lengkap)
 Dalam praktek sehari-hari sulit
mengenal infeksi virus dibandingkan
infeksi bakteri
1. Direct Examination
2. Indirect Examination
(Virus Isolation)
3. Serology
 Direct Examination

1. Antigen Detection immunofluorescence, ELISA etc.

2. Electron Microscopy morphology of virus particles
immune electron microscopy

3. Light Microscopy histological appearance

inclusion bodies
4. Viral Genome Detection hybridization with specific
nucleic acid probes
polymerase chain reaction (PCR)
 Metode pemeriksaan langsung sering juga
disebut metode diagnostik cepat (Rapid
Test) dapat memberikan hasil yang baik
pada hari yang sama atau hari berikutnya.
 Sangat berguna ketika manajemen klinis
pasien sangat tergantung pada
ketersediaan cepat dari hasil laboratorium
diagnosis misalnya infeksi RSV pada
neonatus, infeksi CMV atau
immunocompromised berat pada pasien.
Deteksi Antigen
Contoh deteksi antigen :
 Pemeriksaan imunofluoresensi dari aspirasi
nasofaring untuk virus pernafasan,
misalnya RSV, flu A, flu B, dan adenovirus
 Deteksi antigen rotavirus dalam tinja, test
antigenaemia pp65 CMV
 Deteksi HSV dan VZV pada scrappings kulit
 Deteksi HBsAg dalam serum (dianggap
sebagai test serologis).
KELEBIHAN DAN KELEMAHAN

 Keuntungan utama deteksi gen cepat untuk

melakukan dengan hasil yang tersedia dalam
beberapa jam.
 Kelemahan 
o membosankan dan memakan waktu,

o sulit untuk membaca dan menafsirkan hasil,

o sensitivitas dan spesifisitas rendah

o kualitas spesimen yang diperoleh menentukan

apakah tes dapat bekerja dengan baik.
GAMBARAN HASIL TEST
Electron Microscopy (EM)
 Partikel virus terdeteksi dan
diidentifikasi berdasarkan morfologinya
dengan perbesaran yang biasa
digunakan sekitar 50.000 - 60.000
 EM terutama digunakan untuk
diagnosis virus gastroenteritis dengan
mendeteksi virus dalam tinja misalnya
rotavirus, adenovirus, astrovirus,
calicivirus dan Norwalk-like virus.
 Electron Microscopy (EM)
• EM dapat pula mendeteksi virus dalam
vesikel dan lesi kulit lainnya, seperti
virus herpes dan papilloma.
• Sensitivitas dan spesifisitas dapat
ditingkatkan dengan immune electron
microscopy (antibodi spesifik virus
digunakan untuk menggumpalkan
partikel virus sehingga lebih mudah
dikenali, atau untuk menangkap partikel
virus).
Electron Microscopy (EM)
 Masalah utama penggunaan EM adalah
biaya pembelian dan pemeliharaan
fasilitas tersebut.
 Sensitivitas EM rendah, dengan
setidaknya 10 5 sampai 10 6 partikel
virus per ml dalam sampel yang
diperlukan untuk visualisasi, sehingga
pengamat harus sangat terampil.
Electron Microscopy (EM)

 Dengan tersedianya deteksi antigen

dan metode molekuler untuk
mendeteksi virus yang terkait dengan
virus gastroenteritis, EM menjadi
kurang banyak digunakan.
Electronmicrographs virus umum ditemukan pada spesimen
tinja dari pasien yang menderita gastroenteritis. Dari kiri ke
kanan: rotavirus, adenovirus, astroviruses, Norwalk-like
virus. (Courtesy of Linda M. Stannard, Universitas Cape Town,
http://www.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/emimages.html)
 Replikasivirus sering menghasilkan
perubahan histologis dalam sel yang
terinfeksi.
 Perubahan ini dapat menjadi
karakteristik atau non-spesifik.
 Badaninklusi virus pada dasarnya
kumpulan partikel virus terreplikasi
baik dalam nukleus atau sitoplasma.
 Contoh badan inklusi ditemukan
pada infeksi rabies dan infeksi CMV
.
 Meskipun tidak sensitif atau spesifik,
histologi tetap berfungsi sebagai
tambahan yang bermanfaat dalam
diagnosis infeksi virus tertentu.
Viral Genome Detection
 Metode berdasarkan deteksi genom virus
 metode molekuler.
 Metode molekuler adalah arah masa depan
diagnosis virus.
 Namun peran metode molekuler di
laboratorium diagnostik rutin virus masih
kecil dibandingkan dengan metode
konvensional.
 Viral Genome Detection
 Teknik ini dapat memungkinkan untuk
kuantifikasi DNA / RNA dalam spesimen.
 Namun, sering ditemukan bahwa
sensitivitas dari teknik ini adalah tidak lebih
baik dari metode diagnostik virus
konvensional
Viral Genome Detection
 Teknik molekuler baru seperti polymerase
chain reaction (PCR), ligase chain reaction
(LCR), nucleic acid based amplification
(NASBA), dan branched DNA (bDNA)
bergantung pada beberapa bentuk
amplifikasi, baik target asam nukleat atau
sinyal itu sendiri.
Viral Genome Detection
 bDNA pada dasarnya adalah teknik
hibridisasi konvensional dengan sensitivitas
meningkat. Namun, itu tidak sensitif seperti
PCR dan teknik amplifikasi lainnya.
 PCR adalah teknik amplifikasi yang umum
digunakan. PCR adalah teknik yang sangat
sensitif (mencapai ke 1 molekul DNA
dalam spesimen klinis), namun PCR
memiliki permasalahan.
Viral Genome Detection
 Permasalahan utama  kontaminasi (cukup
sedikit kontaminasi untuk memberikan hasil
positif palsu).
 PCR sangat sensitif dibandingkan dengan teknik
lain, hasil PCR positif seringkali sangat sulit untuk
menafsirkan karena tidak selalu menunjukkan
adanya penyakit.
 Masalah ini khususnya besar dalam kasus virus
laten seperti CMV, karena CMV laten genom
dapat diperkuat dari darah orang sehat.
Viral Genome Detection
 Meskipun demikian, PCR semakin sering
digunakan untuk diagnosis virus, terutama
karena biaya tes yang turun dan
kemampuan sistem automated close yang
juga dapat melakukan kuantifikasi
(Kuantitatif PCR) misalnya real-time PCR
dan Cobas Amplicor Systems.
Viral Genome Detection

 Teknik amplifikasi lain seperti LCR dan

NASBA juga rentan terhadap kontaminasi
seperti PCR tetapi dapat diperbaiki dengan
menggunakan sistem propriatory close (hal
ini sangatlah sulit).
SEMOGA BERMANFAAT
INDIRECT EXAMINATION / VIRUS ISOLATION

 Virusadalah parasit intraseluler obligat

yang membutuhkan sel-sel hidup
dalam rangka untuk replikasi.
 Kultur sel, telur dan hewan
laboratorium dapat digunakan untuk
isolasi virus
 Indirect Examination

1.Cell Culture cytopathic effect (CPE)

haemabsorption
immunofluorescence
2. Eggs pocks on CAM
haemagglutination
inclusion bodies
3. Animals disease or death
 Telur dan hewan cukup sulit untuk
ditangani , sehingga dalam diagnostik virus
di laboratorium tergantung pada kultur sel.
 Pengembangan metode untuk kultur sel-sel
hewan menjadi hal penting untuk kemajuan
virologi hewan.
 Ada 3 jenis kultur sel: primary cells,
semi-continuous cells dan continuous
cells
Primary cells (Sel primer)
 disiapkan secara langsung dari
hewan atau jaringan manusia
yang sudah mati dan dapat
disubkultur hanya sekali atau
dua kali . Contoh : Ginjal
Monyet
Semi-continuous cells (Semi-
kontinyu sel)
 berasal dari jaringan janin
manusia dan dapat disubkultur
20 -50 kali.

Contoh : Ginjal embrio manusia

dan fibroblas kulit.
Continuous cells (Kontinu sel)
 berasal dari tumor manusia
atau hewan, sel-sel ini dapat
disubkulturkan tanpa batas.

Contoh : HeLa, Vero, Hep2,

LLC-MK2, BGM.
 Primary cells secara luas diakui
sebagai sistem kultur sel terbaik
yang tersedia. Namun, sangat mahal
dan seringkali sulit untuk
mendapatkan pasokan yang dapat
diandalkan.
 Continuous cells adalah yang paling
mudah untuk menangani tetapi
berbagai virus yang digunakan sering
terbatas.
Identifikasi tumbuh-kembang virus
 Cytopathic Effect (CPE)
Dapat spesifik atau non-spesifik misalnya
HSV dan CMV menghasilkan CPE yang
spesifik, sedangkan enterovirus tidak.
 Haemadsorption
 sel mendapatkan kemampuan untuk
menempel pada sel darah merah
mamalia .
Identifikasi tumbuh-kembang virus
 Haemadsorption terutama digunakan
untuk mendeteksi influenza dan
parainfluenzaviruses.
 Konfirmasi identitas virus dapat
dilakukan menggunakan netralisasi,
test haemadsorption-inhibition,
imunofluoresensi, atau test molekul.
Kiri: Haemadsorption sel darah merah ke permukaan lembaran
sel yang terinfeksi oleh virus gondok. Juga mencatat kehadiran
dari syncytia yang bisa dibedakan dari RSV (Courtesy of Linda
Stannard, Universitas Cape Town). Kanan: CMV Positif DEAFF
tes. (Virologi Laboratorium, Yale-New Haven Hospital)
PERMASALAHAN KULTUR SEL

 Masalah utama dengan kultur sel adalah

waktu yang diperlukan untuk
mendapatkan hasil cukup lama (sampai
4 minggu).
 Sensitivitas rendah
 Tergantung pada banyak faktor, seperti
kondisi spesimen, dan kondisi lembaran
sel.
PERMASALAHAN KULTUR SEL

 Sangat rentan terhadap kontaminasi

bakteri dan zat beracun dalam
spesimen.
 Banyak virus tidak akan tumbuh pada
semua kultur sel misalnya Hepatitis B
dan C, virus diare, parvovirus dll
 Rapid Culture Techniques
(Teknik Kultur Cepat)

• Teknik kultur cepat

 teknik mendeteksi antigen virus
secara cepat (2 - 4 hari) setelah
inokulasi.
Contoh teknik kultur cepat termasuk
kultur shell vial dan test CMV DEAFF.
 Pada uji CMV DEAFF, lembar sel
ditumbuhkan pada slip cover individu
dalam botol plastik.
 Setelah inokulasi, botol kemudian diputar
pada kecepatan rendah selama satu jam
(untuk mempercepat adsorpsi virus) dan
kemudian diinkubasi selama 2 - 4 hari.
 Slip cover kemudian dibawa keluar dan
diperiksa keberadaan awal antigen CMV
oleh imunofluoresensi.
Metode Asam Nukleat
 PCR (DNA), RT-PCR (RNA)
 Dapat digunakan untuk mendeteksi
virus-virus yang noncultivatable
 Rapid identification (contoh : RT-
PCR—4 Corners untuk wabah
hantavirus atau FRET di lapangan)
 Dapat digunakan untuk menangani
pasien seperti pada virus HIV
SEMOGA BERMANFAAT
 Serology
Mendeteksi meningkatnya titer antibodi antara
tahap akut dan penyembuhan dari infeksi, atau
deteksi IgM pada infeksi primer.

Classical Techniques Newer Techniques

1. Complement fixation tests (CFT) 1. Radioimmunoassay (RIA)

2. Haemagglutination inhibition tests 2. Enzyme linked immunosorbent assay (EIA)
3. Immunofluorescence techniques (IF) 3. Particle agglutination
4. Neutralization tests 4. Western Blot (WB)
5. Counter-immunoelectrophoresis 5. RIBA, Line immunoassay
 CFT
• Prinsip : interaksi Ag-Ab dengan komplemen
• Mengukur penurunan kadar komplemen
serum
• Dapat mengukur kadar Ab yg sangat kecil
 HI
• Pembentukan Ab spesifik HA
• Ag+Ab+eritrosit  HI