ENZIM RESTRIKSI DAN ENZIM LIGASE

Kelompok 3 kelas 3FA1

1.Andre Ryan A 11161004
2.Andriana Saputra 11161006
3.Dwi Sri Hayati 11161016
4.Elinda Yuniarti Rahayu 11161019
5.Erli Berlianti 11161021
6.Gina Halimatu S 11161029
7.M Khairun 11161039
8.Nia Kurniati 11161044
9.Reka Putri R 11161046
10.Lia Nurhayati (4FA1) 11151036
11.Seli Gusti Sukma (4FA1) 11151021
 Pengertian Enzim Restriksi
• Enzim restriksi adalah enzim yang digunakan untuk m
emotong DNA secara spesifik.
• Enzim ini diisolasi dari bakteri.
• Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat ta
npa merusak basa. Setiap enzim mempunyai sekuens p
engenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanja
ng 4-6 pasang basa.
JENIS-JENIS ENZIM RESTRIKSI
 PERKIRAAN PEMOTONGAN
Pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini dip
erkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida.
Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan s
etiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, y
aitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika se
kuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungann
ya menjadi: (1/4)6 = 1/4096.
ENZIM YANG SERING DIGUNAKAN DALAM L
ABORATORIUM
• 4 cutters
Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang mengingink
an pemotongan pada beberapa situs yang potensial. Cont
ohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara ac
ak, dan pada potongan tersebut terdapat gen yang diingin
kan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial digestion) m
enggunakan enzim 4-cutters
• 8-cutters
Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8
nukleotida yang cocok digunakan untuk membentuk krom
osom menjadi potongan-potongan yang spesifik dalam uk
uran yang besar.
Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters) memotong-motong k
romosom E. coli menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI (e
nzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian. Jika langsu
ng menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dih
asilkan terlalu kecil dan banyak. Untuk itu digunakan enzi
m 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan
menggunakan enzim 6-cutters.
• 6-cutters
Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki si
tus pemotongan yang spesifik pada 6 nukleotida. Enzi
m ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning sehari-
hari karena enzim ini lumayan sering memotong satu a
tau dua situs pada plasmid, namun jarang memotong b
agian penting seperti titik asal replikasi (origin of repli
cation) atau gen resistenampisilin. Contoh enzim 6-cutt
ers adalah HindIII (A{\displaystyle \downarrow }AGC
TT) yang memotong genome bakteriofage lambda (48
kbp) pada 7 situs.
 KEADAAN RESTRIKSI

Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7,4

dan suhu 37 °C, serta memerlukan bermacam-maca
m kekuatan ionik, tergantung dari jenis enzimnya. D
alam larutan stok, enzim restriksi biasanya dikemas b
ersama dengan 10X larutan penyangga reaksi yang te
lah dioptimasi.
Buffer reaksi dapat digolongkan menjadi empat jenis berdasarkan
kekuatan ionik-nya:
•0 mM NaCl = low salt buffer (L)
•50 mM NaCl = medium salt buffer (M)
•100 mM NaCl = hi salt buffer (H)
•150 mM NaCl = very high salt buffer (VH)

Contohnya: EcoRI pada buffer reaksi dengan konsentrasi garam r

endah tidak hanya memotong pada situs pengenalan normal G↓A
AATTC, namun akan juga memotong situs pengenalan ↓ AATT.
Aktifitas seperti ini dinamakan star activity.
HASIL PEMOTONGAN ENZIM RESTRIKSI
• Ujung menggantung 5’
Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemot
ongan, menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada uju
ng 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung
5’ adalah BamHI
• Ujung menggantung 3’
Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada sit
us pengenalan, namun menghasilkan hasil pemotongan
memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasi
lkan pola seperti ini adalah KpnI
• Ujung Tumpul
Enzim ini memotong secara simetris antara kedua ut
as DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Co
ntoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini ad
alah SmaI
PERBEDAAN SE DAN BE
CONTOH ENZIM EcoRI
 ENZIM LIGASE
• Ligase merupakan proses memasukan sekuens DNA y
ang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA
genom.
• Ligase menghasilkan produk yang disebut dengan DN
A rekombinan.
• Ligase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis pe
mbentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5'-fosfat da
n 3'-hidroksil yang digunakan saat proses ligasi pada D
NA yang mengalami pemotongan dengan enzim retriks
i sebelumnya.
 KARAKTERISTIK ENZIM LIGASE
• Berupa rantai polipeptida tunggal BM 77000
• Memerlukan gugus OH pada ujung 3’ bebas dan gugus
fosfat pada ujung 5’ rantai yang lain, pembentukan ikat
an fosfodiester ini berupa reaksi endergoni (butuh tenag
a)
• Menyambung 2 mol rantai DNA yang merupakan bagia
n dari DNA double helix (tidak dapat menyambung 2 m
ol rantai tunggal)
 KlASIFIKASI ENZIM LIGASE
• EC 6,1 : termasuk ligases digunakan untuk membentuk ika
tan karbon-oksigen
• EC 6,2 : termasuk ligases digunakan untuk membentuk ika
tan karbon-belerang
• EC 6,3 : termasuk ligases digunakan untuk membentuk ika
tan karbon-nitrogen (termasuk sintetase argininosuccinate
)
• EC 6,4 : termasuk ligases digunakan untuk membentuk ika
tan karbon-karbon
• EC 6,5 : termasuk ligases digunakan untuk membentuk fos
fat ester obligasi
• EC 6,6 : termasuk ligases digunakan untuk membentuk ika
tan logam nitrogen
 JENIS-JENIS ENZIM LIGASE
1. T4 DNA Ligase
 T4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini ak
an meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki u
jung kohesif maupun ujung tumpul.
 Untuk meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpu
l, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar.
 Memerlukan larutan penyangga yang mengandung ATP de
ngan konsentrasi 0.25-1 mM.
2. T7 DNA Ligase
Merupakan DNA ligase dengan ukuran terkecil, ya
itu sebesar 41 kDa.
DNA ligase ini berasal dari bakteriofage T7, memp
unyai struktur yang terdiri dari dua domaindengan s
isi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain y
ang lebih besar.
MEKANISME KERJA ENZIM LIGASE
 DAFTAR PUSTAKA
• Owen RA, Austgen L, Rouge M. 2002. Biology and Activity of
Restriction Endonucleases [5 Apr 2010].
• Metzenberg S. 2002. Restriction Endonucleases. [12 Apr 2010].
• Sasnauskas G, Connolly BA, Halford SE, Siksnys V. 2007. Site-
specific DNA transesterification catalyzed by a restriction enzy
me Proc Natl Acad Sci USA 104(7): 2115-20.
• ^Rinehart CA. 2005. Restriction enzymes and Ligases. [3 Apr 2
010].
• Pingoud A, Jeltsch A. 2001. Structure and function of type II res
triction endonucleases. Nucleic Acids Res 29(18): 3705-27
TERIMAKASIH