COLORACIÓN DE PAPANICOLAOU ( PAP)

PRINCIPALES OBJETIVOS DE LA TINCIÓN DE

MATERIAL CITOLÓGICO.

• Visualización óptima de las células.

• Diferenciación de los diferentes constituyentes Celulares.
• Adecuado análisis y evaluación específica de la Estructura nuclear.
• Análisis citoplasmático.
 Principio Y Ventaja Del Método De Tinción De Papanicolaou

• La tinción de Papanicolaou es un método de tinción policromático( dado que puede

teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula) que consta de una
tinción nuclear y un contraste citoplasmático la cual tiene como ventaja:
 Una buena definición del detalle nuclear, evidenciando el patrón de cromatina de
las células.
Un aspecto transparente de los citoplasmas y una diferenciación celular, que
permite apreciar grados de maduración celular y actividad metabólica.
.
La tinción de Papanicolaou tiene
cuatros pasos principales:
•Fijación (realizada al momento de tomar la muestra).
• Tinción del núcleo con la hematoxilina.
•Tinción del citoplasma con orange g y ea.
• Aclaramiento.
 La tinción de Papanicolaou usa tres colorantes:

Og 6 ( Orange)
Hematoxilina de harris
Tiñen los EA 50 ( Eosina alcohol)
Que tiñe
selectivamente los núcleos
citoplasmas Tiñen los citoplasmas
 Los pasos de la tinción están entremezclados con
soluciones que hidratan, deshidratan y enjuagan
las células

Tinción.: Es importante señalar que éste es un procedimiento que tiene variaciones e incluso
preferencias personales en la coloración

Enjuague: El se realiza con agua corriente y/o agua destilada, pero siempre hay que verificar que
el pH del agua se encuentre entre 6.5 y 7.

Hidratación: La hidratación antes del colorante de hematoxilina puede ser:

Gradual usando alcohol en concentraciones decrecientes 80-70-50 %
Abrupta, sumergiendo el material celular desde altas concentraciones de alcohol y al agua
directamente
Tinción del núcleo.
la hematoxilina es un colorante natural que tiene una afinidad por la
cromatina y tiñe el núcleo
Existen dos métodos para teñir el núcleo:
• Método progresivo. Se tiñe el núcleo con la intensidad de color deseada.
• Método regresivo. Se sobre-tiñe con hematoxilina no acidificada, luego
se remueve el exceso de tinción con ácido clorhídrico diluido.
• Después de la hematoxilina, las laminillas se lavan en agua.
Tinción del citoplasma.
• Orange g 6 ( o g6 ), es una tinción monocromática que colorea la
queratina de un naranja brillante y penetra rápidamente al citoplasma.
• Ea 50 ( eosina alcohol ) , es una tinción policroma compuesta de eosina,
verde luz y café ( en la formula original ) tiñe el citoplasma de las células
escamosas cianofílas y eosinofílas, nucléolos y cilios.
Aclaramiento. Es el paso final de la tinción y produce
transparencia celular. Se suele usar xilol como solución aclaradora
•Montaje de laminas: es una unión entre el porta objeto y
cubre objeto, mediante una sustancia, con el fin de obtener
una muestra cubierta y protegida contra el secado y
arrugamiento del material celular y sellada para evitar la
oxidación de la muestra
• Existen dos opciones como medio de montaje: el bálsamo
de Canadá y la resina sintética
Preparación y manejo de la batería de
tinción
Batería de tinción: Es un conjunto ordenado de cubetas con reactivos y
colorantes en las cuales se procesan las muestras en forma secuencial
para ser teñidas.
Disponer o preparar los reactivos y colorantes depende de cada
laboratorio
 Resultado
• Losnúcleos se tiñen de azul a violeta ,
mientras que el citoplasma muestra varios
tonos de azul, naranja, rosa o rojo
Citoplasma Verde azulado
basófilo
Citoplasma Rosa
acidofiló
Citoplasma Rosa a naranja
queratinizados
Eritrocitos rojo
Núcleos Azul a violeta
Cuidados a los colorantes
•Se deberán tener los siguientes cuidados:
1. Verificar que las soluciones estén rotuladas indicando:
A. Fecha de preparación.
B. Nombre de la solución.
C. Titulación.
D. Concentración.
E. Requisitos para almacenar.
F. Advertencias para su manejo.
G. Fecha de vencimiento
• 2. Conservar los colorantes en:
A. Envases oscuros
B. Bien tapados porque son sensibles a la luz. • 3 La batería de
C. Se oxidan a temperatura ambiente. tinción se
D. Almacenar las soluciones inflamables en cambiara:
un área aprobada anti-fuego.
E. No manejar los colorantes cerca de estufas • A. Cada 2000 laminas
o fuentes oxidantes. teñidas.
F. Almacenar las soluciones de tinción entre
15°C Y 25°C. Después de abrir el frasco si es • B. Cada 6 U 8 semanas
almacenado entre 15°C y 25°C es utilizable
hasta la fecha de caducidad indicada
 A. Preparar una batería de tinción exclusiva para las
3. BATERÍA DE muestras de examen de papanicolaou.

TINCIÓN: B. Rotular las cubetas.

La batería de tinción
se cambiara:
A. Cada 2000 laminas teñidas.
B. Cada 6 U 8 semanas
C. Los colorantes se deben filtrar inmediatamente antes
de llenar las cubetas, usando un embudo y papel filtro.
D. La batería de tinción requiere estar bajo campana de
extracción de gases.
E. La batería de tinción debe encontrarse en una sala con
buena ventilación.
5. Si el laboratorio procesa muestras no ginecológicas,
estás deben teñirse en una batería diferente, pera prevenir
el riesgo de contaminación cruzada.
 MANTENIMIENTO DE LOS COLORANTES

Mantenimiento general. Mantenimiento específico.

Filtrar los colorantes cada 8 días. En la hematoxilina, se debe retirar la capa
Limpiar las cajas de todo residuo de colorante de aspecto metálico que se forma sobre el
Controlar diariamente el nivel de las colorante
soluciones de la batería de tinción. Rellenar las
cubetas si falta solución.  El orange g y ea deben ser remplazados
cada semana.
 Tapar las cubetas con soluciones y colorantes
cuando no se usen y el mayor tiempo posible
cuando estén en uso, para evitar evaporación
Tinción de las muestras

• 1.-Poner las láminas en los carros de tinción, ordenadas y todas en la misma posición. El técnico debe
trabajar con guantes.
• 2.-Se especifica el procedimiento detallado de tinción con el método regresivo para tinción nuclear
• Se recomienda que cada laboratorio mantenga por escrito su procedimiento de tinción en un lugar visible
de la sala de procesamiento de tinción
• Eliminación del fijador.
• Para iniciar el proceso de tinción nuclear es necesario eliminar el fijador de las laminillas, que usualmente
es en base a polietilenglicol. Para ello se realiza un lavado con agua destilada o sumergiendo las láminas
en etanol al 95%, seguido por un lavado con agua destilada.
• Evitar problemas con los alcoholes o colorantes.
• Los carros de tinción deben ser completamente escurridos entre una y otra cubeta para evitar la dilución
de los colorantes o la alteración de los alcoholes, sin llegar al secado del frotis
• Tiempos de inmersión.
• Cada inmersión del carro de tinción con laminas en las cubetas de soluciones o
colorantes debe durar 1 0 2 segundos y se efectúa suavemente sin llegar a tocar
la base de la cubeta, para que no se desprendan las células.
• Intentar mantener las cubetas tapadas el mayor tiempo posible durante el
proceso de tinción.
• Las láminas teñidas se deben mantener en una cubeta con xilol hasta el
momento del montaje.
• Asear cuidadosamente los materiales ocupados y la superficie de trabajo una
vez terminada la tinción de un conjunto de láminas.
• Lavarse cuidadosamente las manos.
 Montaje de las láminas

• Todo el procedimiento de montaje de las láminas debe realizarse bajo campana de

extracción de gases si se usan medios de montaje con solventes
• Tomar, bajo la campana de extracción de gases, la laminilla teñida y retirarla de la canastilla.
Revisar que esté seca la parte posterior de la muestra, antes de iniciar el montaje.
Utilizar un medio de montaje de preferencia de secado rápido.
Aplicar una gota de resina sobre el portaobjetos y colocar sobre éste el cubreobjetos.
Retirar el excedente de resina y colocarla sobre la charola ordenadamente.
Asear cuidadosamente todos los implementos usados para procesar muestras
Puede ocurrir contaminación cruzada durante el montaje si el gotario o la pipeta usada para
aplicar el medio de montaje toca las células de una muestra y después de otra muestra.
 Problemas Más Frecuentes En Coloración

Coloración nuclear muy pálida puede deberse a:

• Extendidos que se desecaron antes de ser fijados.
• Fijador con aerosol mal agitado antes de usar o aplicado muy cerca o muy
lejos del extendido.
• Deficiente remoción del fijador de los extendidos.
•Hematoxilina contaminada con fijador, esto reduce su capacidad de penetrar al
núcleo.
• Tiempo insuficiente de inmersión en la hematoxilina.
•Hematoxilina diluida con agua debido a que las láminas no fueron bien
escurridas.
• Hematoxilina poco madura.
•Tinción antigua, sobre usada o usada por un tiempo mayor del recomendado.
•Lavado en agua corriente con mucho cloro (muy ácida) o por tiempo excesivo .
Coloración nuclear oscura puede deberse a:
• Células sobre teñidas en extendidos irregulares, con áreas gruesas y delgadas.
• Extendidos hemorrágicos o proteínicos hacen que el ph cambie y haya mayor
afinidad por la hematoxilina (se pueden lavar previamente con solución salina
balanceada).
• Muestra sobre teñida en la Hematoxilina de Harris, por tiempo excesivo de
colorante.
• Exceso de tinción no removido por los enjuagues posteriores a la hematoxilina.
• Láminas fijadas en alcohol de mayor concentración.
Coloración citoplasmática pálida:

• Exceso en el tiempo de inmersión en alcohol después de orange G y EA 50.

Déficit en el contraste del citoplasma:

• Colorantes sobre usados.

• Extendidos sumergidos por menos tiempo del recomendado en los colorantes Orange g
y ea 50.

Citoplasma demasiado verde, azul o rosado:

• Debe revisarse el colorante EA 50, puede tener un exceso de colorante verde u otra
variación.

Citoplasma rojizo o rosado sin
diferenciación:
• Extendido seco antes de ser fijado.
• Bacterias cocáceas
• Colorante sobre usado.
Citoplasma gris o púrpura:
• Exceso de tinción de hematoxilina o
inadecuada remoción del exceso de la
misma.
Lámina irregularmente teñida:
• Fijador con aerosol mal agitado antes de usar.
• Fijación irregular.
• Deficiente remoción del polietilenglicol del
fijador.
• El nivel de los colorantes está por debajo del
recomendado.
• Sumersión inadecuada o insuficiente.
• Falta de agitado durante coloración .
• lavado de láminas insuficiente.
• Láminas no correctamente separadas unas de
otras. Grosor irregular de la muestra