Insulin & human growth

hormone by E.coli

Edited by Prof. Dr. Sudjadi

 DAFTAR PUSTAKA
 BR GLICK & JJ PASTERNAK
MOLECULAR BIOTECHNOLOGY
 DJA CROMMELIN & RD SINDELAR
PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY
 Sudjadi, Bioteknologi Kesehatan
 Rekayasa genetika mempunyai peran
sangat penting, tidak hanya penelitian
ilmiah, tetapi juga dalam diagnosis
penyakit dan pengobatan
 rDNA bukan Kloning Hewan

DNA rekombinan merupakan alat/cara

untuk memahami struktur, fungsi dan
pengendalian gena dan produknya
 Tujuan teknologi DNA rekombinan
meliputi :
– Identifikasi gena
– Isolasi gena
– Modifikasi gena
– Re-ekspresi gena dalam organisme lain
 Rekayasa genetika memungkinan para
ilmuan dan dokter:
– Identifikasi gena baru dan proteins yg
disandi
– Perbaikan kelaian genetik
– Memproduksi protein seperti hormon,
vaksin dalam jumlah besar
 Contoh Proses
Apa kegunaan ligase DNA ?
Apa kegunaan enzim restriksi?
Mengapa plasmid diunakan sebagai
vektor kloning ?
Produksi insulin manusia dlm E.coli
Prinsip kloning
PEMOTONGAN DNA dgn enzim restriksi HpaI
Pemotongan DNA dg EcoRI
 Vektor kloning
 Suatu vektor digunakan utk amplifikasi satu
molekul DNA (gena) menjadi banyak. Fragmen
DNA yg membawa gena disisipkan dlm suatu
vektor kloning. Vektor kloning (pBR322,
pUC18/19) mrpk molekul DNA yg mempunyai
awal relikasi (ori) dan dapat bereplikasi dlm sel
bakteri.

 Vektor kloning telah direkayasa genetika sesuai

dengan keperluannya.
 PENAPISAN

 PELACAK DNA
 ANTIBODI
Rekayasa genetika memungkin:

Isolasi/produksi protein murni dlm jumlah

besar:
Insulin, growth hormone, follicle-stimulating
hormone, protein lain, sekarang terdapat dlm
produk rekombinan. Pengguna tidak lagi
tergantung pd produk biologi yg kurang
murni dg aktivitas spesifik rendah dg
inconsistent batch preparation
Case Study: Penggunaan
DNA Recombinan utk
Produksi Insulin Manusia
 Protein rekombinan human sbg
agen terapitik
Protein manusia menghasilkan efek samping lb kecil
drpd protein hewan
(mis insulin babi vs. Insulin manusia)

-- Hormon
Protein spt hormon
Terapi penganti
-- Enzim Utk kelainan genetik

-- Antibodi

-- Protein sbg vaksin

Mengapa mensintesis insulin
manusia?
 Sistem imun pasien tdk memproduksi
antibodi thdp insulin manusia,
sedangkan thdp insulin babi/sapi akan
memproduksi antibodi

 Diperlukan metode yg tervalidasi utk

menghasilkan produk sama dari waktu
ke waktu
 Struktur Insulin
 Dua rantai polipeptid; satu dg 21 asam
amino dan yg kedua dg 30 asam amino

 Kedua rantai dihubungkan dg ikatan

disulfida

 Gena penyandi protein insulin tdpt pd

kromosom 11
Pada kenyataan kedua rantai
terdapat dalam satu protein
(proinsulin)

www.blc.arizona.edu/.../rick/ biomolecules/protein.html
 Insulin manusia- pertama
Pustaka gena manusia ditapis dan gena INS kmdn
dipindahkan pd vektor ekspresi dg promoter lac utk
transkripsinya

Ekspresi dlm E. coli dlm inclusion bodies penuh dg insulin

Isolasi insulin dari inclusion bodies
Lama dan mahal
http://www.apsu.edu/reedr/Reed%20Web%20Pages/Chem%204310/Lectures/recomb1.jpg
 Humilin (Eli Lilly, 1986) –
insulin pertama yg diproduksi scr
industrial
24 aa signal laeder peptida dipasang pd ujung 5‘.

Insulin masuk ke media tdk dlm inclusion bodies

(Signal leader mengakibatkan insulin dibawa melewati
membran sel )

Rantai A dibuat dlm satu E. coli

Rantai B dibuat dlm E. coli berbeda

Kedua rantai masing2 dimurnikan

kemudian disatukan

Digunakan teknik fermentasi biakan kontinyu

 Human Growth Hormone (HGH)
(somatotropin)
 HGH memicu pertumbuhan badan
dg menaikkan pengambilan asam amino oleh sel, sintesis protein
dan penggunaan lemak utk energi f
Produksi HGH yg kurang oleh kelenjar pituitary = kerdil
 Muka gemuk
 Pinggang spt anak gemuk
 Tinggi badan hanya sekitar ~ 4 feet
 IQ = Normal

HGH menolong anak penderita mencapai ukuran dan berat

normal

http://www.hopkinsmedicine.org/hmn/F01/photos/36.jpg
 Keingginan menggunakan HGH utk
memicu pertumbuhan anak yg bukan penderita
ttp orang tuanya ingin anaknya tumbuh tinggi.

pada 2003, the U.S. FDA menyetujui

penggunaan human growth hormone (HGH) for
anak laki yg diduga tingginya kurang dari 5′3″
dan utk gadis 4′11″

If adult suffers with hypopituitarism,

HGH therapy is also available
as normally payable under an insurance policy.
 Jaman produksi pre-recombinan HGH

HGH dapat dimurnikan kelenjar pituitary mayat

8 mayat/tahun utk satu anak 8 – 10 th
Creutzfeldt-Jacob Disease (CJD) mrpk resiko penggunaan jaringan otak
24 kasus pd 1993 di Perancis krn penggunaann HGH

news.bbc.co.uk/1/hi/ health/2136673.stm
umed.med.utah.edu/.../lectures/ inf/baringerimg/brain.htm
 10_25_cDNA.jpg

Membuat cDNA
dari mRNA dg
reverse transcriptase
dan DNA
polymerase
 Protropin (Genentech) and
Humatrope (Eli Lilly)
Terapi hGH therapy sangat mahal, sekitar $800 to $2,500 sebulan

Human GH alami mengandung peptida signal yg

mengarahkan protein itu ke RER pd eukaryot
Peptide s tdk dpt disentesis dlm E.coli

Signal dihilangkan dg dipotong enzim restriksi EcoRI

24 asam amino ditambahkan sbg pengganti peptida signal

Dapat diekspresidlm E. coli

 Sintesis Biofarmasetik via
Mikroorganisme Rekombinan
 Pada awalnya hanya protein obat,mis insulin
 Sekarang meliputi obat dg BM rendah
 Vitamin
 Asam Amino
 Antibiotik

 Digunakan utk menaikkan jumlah dan/atau

turunan baru yg lb poten
 Bakteri sebagai pabrik kimia

Material produk dg
awal nilai tambah

• memperbanyak diri
• Mengkatalisis reaksi bertingkat
• ramah lingkungan
• meterial awal mudah diperoleh
Artemisia annua
Artemisinin

O O
O

O
Kadar 0,01 – 0,3%
If you believe in yourself,
if you really stick to things,
and if you always remember to Allah,
there is very little that is really impossible”.

SUKSES BUAT ANDA

 Artemisinin
O O
O  Kebanyakan negara berkembang
anggaran kesehatan
O
$4/orang/tahun
O

 World Health Organization

memperkirakan kebutunan 700
ton/tahun
 Produksi artemisinin via bakteri
 Keuntungan
 Fermentasi bakteri relatif sederhana utk menaikkan
skalanya
 Digunakan meteri/nutrien murah

 Tantangan
 Diperlukan gena utk semua enzim dlm alur biosintesis
 Tidak selalu mudah mengekspresikan gena dari
organisme lain dlm bakteri
 Diperlukan keseimbangan metabolisme utk optimasi
produksi
 Sntesis artemisinin dlm E. coli

Identifikasi enzim
 Synthesis of
artemisinin in E. coli
mengklon gena
 Synthesis of
artemisinin in E. coli
Karakterisasi sitem
regulasinya
 Synthesis of
artemisinin in E. coli
Tambahkan
prekursor
intraseluler
 Vektor gena utk rekayasa metabolisme
Plasmid
If you believe in yourself,
if you really stick to things,
and if you always remember to Allah,
there is very little that is really impossible”.

SUKSES BUAT ANDA