Sample Preparation

and TLC Analysis

of Phenolic Acids
Kelompok 14
1. Umul Achmad Nurullah
(162210101143)
2. Hendri Hidayatullah
(162210101145)
3. Dimas Wakhid Setiawan
(162210101147)
4. Novia Andriyani
(162210101153)
Definisi
• Asam fenolat adalah metabolit sekunder pada tumbuhan aromatik. Asam fenolat mempunyai 2 kelompok utama
yaitu:
1. Turunan asam sinamat : ferulat, kafeat, p-kumarat, m-kumarat, o-kumarat, sinapic, asam, dan kurkumin.
2. Turunan asam benzoat : galat, p-hidroksibenzoat, vanili, protokatekuat, salisilat, syringic, veratric, dan
asam gentisat.
• Paling sering terjadi pada tumbuhan adalah turunan asam sinamat : kafeat, benzoat, p-kumarat, vanili, ferulat, dan
protokatekuat.

3
Aktivitas Biologis Dan Farmakologi Asam Fenolik
• Asam fenolat yang tidak larut ditemukan dalam dinding sel, sedangkan yang larut ditemukan dalam vakuola.
• Suhu dapat mempengaruhi kandungan asam fenolat.
• Semua bentuk asam fenolat larut dalam pelarut organik.
• Depsides adalah intermolekuler ester yang dibentuk oleh kondensasi dari dua atau lebih molekul dari asam fenolat
yang sama atau berbeda dimana kelompok karboksil satu molekul di esterifikasi dengan gugus hidroksil fenolik
yang kedua.
• Senyawa yang termasuk depsides adalah rosmarinat, klorogenat, ellagic, m-digallic, cetraric, asam lekanorat, dan
cynarin.
Klasifikasi Biosintesis Kimia
Asal biosintesis dari turunan asam sinamat dari aromatik asam amino L-phenylalanine,
yang disintesis dari chorismate dengan produk yang didapat pada jalur shikimat.
Turunan asam benzoat memiliki memiliki 2 jalur antara lain:
1. Degradasi rantai samping dari turunan asam hidroksininnamik.
2. Jalur shikimat yang melibatkan serangkaian reaksi enzimatik dari berubah 3-
dehydroshikimate ke berbagai turunan asam benzoat.

Biosintesis dari Asam Fenolat

Aktivitas Biologis Asam Fenolat

• Aktivitas biologis dari asam fenolat :

1. Adstringen (asam rosmarinat)
2. Sedative (asam rosmarinat dan asam klorogenat)
3. Choleretica dan cholekinetica (sebagian besar asam fenolik)
4. Hepatoprotektif
5. Analgetik
6. Antipiretik dan
7. Keratolitik (asam salisilat).
Aktivitas Farmakologi Asam Fenolat
• Beberapa asam fenolat (asam kafeat, gentisic, rosmarinat, ferulat, salisilat, kurkumin,
dan beberapa depsides) memiliki sifat antiinflamasi dan antirematik.
• Asam kafeat sebagai blocker selektif dari biosintesis leukotrien.
• Asam gentisic menghambat COX2 dan enzim 12-lipoksigenase dan juga untuk
menurunkan produksi leukotrien.
• Beberapa lichen depsides dapat menghambat pembentukan leukotrien.
• Turunan asam kafeat juga terbukti menjadi inhibitor yang selektif terhadap
integrase HIV-1.
• Asam ferulat menunjukkan aktivitas terhadap bakteri gram positif, bakteri gram
negatif, dan ragi. Asam ferulat menunjukkan penghambatan yang kuat pada
pertumbuhan beberapa mikroflora gastrointestinal manusia termasuk Escherichia
coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Klebsilla pneumoniae, Enterobacter
aerogenes, Citrobacter koseri, dan Shigella sonnei.
• Berdasarkan studi klinis dan in vitro, asam ferulat menunjukkan aktivitas inhibitor
tromboksan A2 sintetase dan agregasi trombosit darah.
• 4-Hydroxybenzoic acid menunjukkan efek hipoglikemik dan dapat meningkatkan
kadar insulin serum dan kandungan glikogen hati.
• Asam klorogenat dapat mengurangi glikogenolisis hati dan menurunkan absorpsi
glukosa.
Metode Analitis Isolasi Dan Pemurnian
Asam Fenolik
Ekstraksi asam fenolik dari bahan tanaman menggunakan metode
konvensional seperti ekstraksi cair-cair (LLE) atau kromatografi kolom. Langkah
pertama menggiling sampel untuk meningkatkan luas permukaan,
yang memungkinkan kontak yang lebih baik antara pelarut ekstraksi dengan
sampel. Selain Itu juga membantu dalam pencampuran sampel untuk
memastikan bahwa bagian yang diekstraksi adalah seluruh sampel. Karena
banyak senyawa fenolik dalam bentuk glikosida atau ester, maka perlu
penambahan asam sebagai hidrolisi glikosida tersebu.
HIDROLISIS ESTER DAN GLIKOSIDA
Ada dua prosedur utama untuk menghidrolisis ester dan ikatan glikosida yaitu hidrolisis
asam (untuk glikosida), dan hidrolisis basa (untuk ester). Teknik ketiga, kurang umum
adalah pembelahan penggunaan enzim (esterase atau glukosidase). Meskipun waktu
reaksi dan suhu untuk kondisi hidrolisis asam bervariasi, metode umum ini melibatkan
ekstrak tumbuhan itu sendiri dengan asam anorganik (HCl) di atas suhu refluks dalam air
atau pelarut alkohol (metanol menjadi asam yang paling umum, berkisar antara 1 hingga 2
M HCl encer, dan waktu reaksi berkisar dari 30 menit hingga 1 jam. Campuran 2 M HCl
dan metanol (1: 1, v = v) pada 100OC selama 1 jam menghasilkan pemulihan tertinggi
(30% -65%). Kedua metil ester dan asam karboksilat. Pelarut seperti etanol, tert-butil
alkohol, dan 2-propanol memberi hasil yang lebih rendah, dan HCl encer dapat
menghancurkan hidroksisinnamik asam. Hidrolisis alkali (saponifikasi) memerlukan
perawatan sampel dengan larutan NaOH dengan konsentrasi dilaporkan mulai dari 1
hingga 4 M. Sebagian besar reaksi berdiri pada suhu kamar untuk waktu mulai dari 15
menit hingga semalam, meskipun pada hidrolisis jus anggur dengan 1,5 M NaOH selama
62 jam.
Pemurnian dan Pengentalan Sampel
Bunga dan daun hawthorn digiling menjadi bubuk, lalu
diekstraksi dengan air metanol dan metanol murni, dan difraksinasi dengan
poliamida dan Sephadex LH-20 kolom. Fraksi A1, A2, A3, B1, dan B2
diperoleh (Gambar 14.5). Itu kolom poliamida dielusi setelah fraksi A3
dengan aseton dan air (7: 3) untuk ekstrak procyanidins polimer teradsorpsi
dalam fraksi A4. Fraksi pertama A1 terelusi dari kolom poliamida dan fraksi
pertama B1 yang dielusi dari Sephadex Kolom LH-20 digabungkan dan
diuapkan sampai kering. Lima mililiter air ditambahkan ke residu dan pH
secara bersamaan disesuaikan dengan 7.0 dengan 1 MNaOH. Solusi netral
ini dimuat ke cartridge Sep-Pak C18 plus, diprakondisikan dengan metanol
dan selanjutnya dengan air suling (pH 7). Setelah menambahkan sampel,
cartridge dielusi dengan air (pH 7) untuk menghilangkan karboksilat fenolik
asam (fraksi X). Kartrid kemudian dielusi dengan metanol untuk
mengekstraksinya flavonoid teradsorpsi dan epikatekin (fraksi Y). Asam-
asam karboksilat fenolik diisolasi dari larutan berair (fraksi X) dengan
mengasamkan ke pH 3 dengan 1 M HCl dan ekstraksi secara berurutan
dengan etil asetat dan dietil eter. Pelarut diuapkan, residunya dilarutkan
metanol, disaring dan dianalisis oleh HPLC .
Liquid–Liquid Extraction (Ekstraksi Cair-Cair)
LLE adalah prosedur yang sering digunakan untuk
pemurnian fraksi asam fenolik. Semua ekstrak diuapkan sampai
kering di bawah tekanan yang dikurangi dan dimurnikan oleh LLE.
Residu kering, direndam dengan air mendidih, didinginkan dalam
lemari es selama 12 atau 24 jam dan kemudian disaring. Endapan
resin dicuci dengan air suling dan filtrat dihilangkan lemaknya
dengan ekstraksi ganda dengan petroleum eter. Larutan berair (I)
diekstraksi dengan dietil eter.Asam fenolik yang terkandung
dalam lapisan dietil eter selanjutnya diolah dengan 5% natrium
bikarbonat untuk mengubah asam fenolik menjadi garam natrium
yang larut dalam air.Lapisan bikarbonat diasamkan dengan 36%
asam hidroklorat sampai pH 3 dan, setelah itu, diekstraksi
terhadap dengan dietil eter.Ekstrak eter gabungan dikeringkan
dengan Na2SO4 anhidrat.Setelah penguapan dari pelarut fraksi
kering asam fenolik bebas diperoleh.
 Satu bagian dari larutan (I) diasamkan
dengan 36% asam hidroklorat (sampai pH 2),
dipanaskan selama 1 jam 60oC untuk mengubah
glikosida menjadi asam fenolik bebas dan kemudian
diekstraksi dengan dietil eter. Ekstrak eter gabungan
dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat.Setelah
penguapan dari pelarut fraksi kering asam fenolik
bebas setelah hidrolisis asam diperoleh.
Ke bagian kedua larutan berair (I)
ditambahkan 1 g NaBH4 dan 10% Ba (OH) 2 (hingga
pH 12) dan campuran dipanaskan selama 15 menit
pada 60oC.Selanjutnya, larutan diasamkan dengan
H2SO4 hingga pH 2 dan diekstraksi dengan dietil
eter.Ekstrak eter gabungan dikeringkan dengan
Na2SO4 anhidrat. Setelah penguapan dari pelarut
fraksi kering dari asam fenolik bebas setelah hidrolisis
dasar diperoleh.
Solid-Phase Extraction (Ekstraksi
Fase Padat)
SPE membuat persiapan sampel lebih cepat dan
mudah.Semua ekstrak diuapkan sampai kering di bawah tekanan
yang dikurangi dan dimurnikan oleh SPE.
Kolom C18 diprakondisikan untuk fenol netral dengan
melewatkan secara berurutan metanol dan air yang disesuaikan
dengan pH 7 dan untuk asam fenolik dengan metanol yang lewat
secara berurutan dan 0,01 M HCl. Sampel yang mengandung asam
askorbat untuk menghindari oksidasi polifenol, disesuaikan dengan
pH 7 dengan NaOH, dimuat ke kolom fraksinasi netral C18, dan dicuci
dengan air. Bagian efluen diatur sampai pH 2 dengan 2 M HCl,
melewati kolom asam yang dikondisikan sebelumnya, dan dicuci
dengan 0,01 M HCl. Fraksi teradsorpsi dielusi dengan metanol dan
diuapkan sampai kering. Residu dilarutkan kembali dalam metanol,
disaring, dan dianalisis.

14
Aplikasi Tlc Dalam Analisis Asam Fenolik
Campuran dari tiga, empat, atau bahkan lima pelarut dengan berbagai polaritas
digunakan sebagai fase gerak. Biasanya, pelarut nonpolar atau polar lemah
(misalnya, benzena, heptana, toluena), pengencer kutub sedang seperti
kloroform atau etil asetat, dan pengubah kutub kuat (misalnya, metanol, air)
dicampur untuk mendapatkan selektivitas pemisahan terbaik. Selain itu, asam
asetat atau formiat dalam kisaran konsentrasi 0,5% -1% ditambahkan ke fase
gerak untuk menekan ionisasi gugus asam dan memperbaiki bentuk pita
kromatografi.

15
TLC Isocratic
Saat ini, banyak sistem TLC telah dikembangkan untuk
pemisahan senyawa fenolik. Lebih banyak komponen polar yang
terserap kuat pada permukaan silika, seperti asam klorogenik,
ellagik, atau rosmarinic biasanya dikromatografi dalam sistem
pelarut yang terdiri dari etil asetat = asam format = air dalam rasio
yang berbeda (8: 1: 1, 65:15:20, 88). : 6: 6). Dalam beberapa
publikasi, asam format diganti dengan metanol, 1-propanol, atau 1-
butanol. Campuran etil asetat = asam format = asam asetat = air
(100: 11: 11: 27) yang diusulkan oleh Wagner juga sering digunakan .
17
PENGEMBANGAN TLC SATU DIMENSI GANDA
TLC isokratik sering tidak memadai untuk resolusi
komponen yang ada dalam sampel yang kompleks. Dalam teknik ini
pelat dikromatografi berturut-turut beberapa kali dengan pelarut
yang sama atau kekuatan eluen yang bervariasi dan dikeringkan
dengan hati-hati setelah setiap langkah pengembangan. Teknik MD
memungkinkan pemisahan senyawa dengan struktur kimia yang
serupa.Gambar 14.8 menyajikan MD dari ekstrak dari Polygoni
avicularis herba setelah hidrolisis basa dengan campuran asam
diisopropil eter-heptana-formic (5+4+1).
TLC DUA DIMENSI
TLC 2D dapat untuk memisahkan asam fenolik
• TLC 2D biasanya hanya digunakan untuk
penentuan kualitatif karena perbandingan zat
dengan standar yang sulit
• Medic et al.. menyatakan KLT 2D juga dapat
digunakan untuk analisis kuantitatif asam
caffeic dalam propolis
• Lempeng dikembangkan dengan eluen
pertama n-heksana = etil asetat = asam
asetat glasial (31: 14: 5) dan dengan eluen
kedua kloroform = metanol = asam format
(44: 3,5: 2,5)
DETERMINASI KUANTITATIF DARI ASAM FENOLIK TLC
• TLC sering dikombinasikan dengan densitometri untuk analisis
kuantitatif senyawa fenolik
• Densitometer modern memiliki keuntungan cepat, murah, dan sensitif
untuk analisis rutin yang melibatkan banyak sampel. Selain itu, juga
dapat untuk konfirmasi identitas senyawa yang diteliti berdasarkan
perbandingan spektrum UV-VIS standar dan sampel langsung pada
pelat kromatografi.
• Keuntungan dari TLC adalah dapat menentukan beberapa senyawa
pada pelat kromatografi yang sama.

Densitogram ekstrak dari propolis yang berhasil dipisahkan

pada lempengan silika dengan fase gerak asam format
diklorometana-asetonitril-90%, 9,5+0.5+0.1 v/v
21
• Densitometri dilakukan untuk mengukur absorbansi pada panjang
gelombang 320 nm. Batas deteksinya adalah 29,50 ng untuk asam
caffeic, 8,33 ng untuk asam p-coumaric dan 17,20 ng untuk asam ferulat
• Umumnya, parameter validasi yang diperoleh adalah koefisien korelasi
(r2> 0,99), standar deviasi relatif yang dapat diterima, nilai pemulihan,
dan batas deteksi dan kuantifikasi yang memungkinkan penggunaan TLC
dengan densitometri dalam percobaan.

22
METODE DETEKSI ASAM FENOLIK

1. Asam fenolat mudah di deteksi indikator fluoresence

• Setelah terpapar ultraviolet (biasanya pada panjang gelombang 254 nm),
emisi adsorben berkurang di daerah di mana senyawa aktif menyerap
sinar UV.
• Mereka muncul sebagai noda terang terang pada latar belakang gelap.
• Eksitasi biasanya dilakukan menggunakan radiasi pada panjang
gelombang 366 nm.
2. Deteksi sederhana dengan uap amonia
Senyawa fenolik harus diamati dalam sinar UV pada panjang gelombang 254
atau 366 nm.
3. Dilakukan derivatisasi dengan menyemprot atau mencelupkan dengan
berbagai reagen
• Digunakan Larutan metanol besi (III) klorida atau aluminium klorida
dalam konsentrasi 2% -3%.
• Diazotized sulfanilic acid dan penyemprotan dengan larutan natrium
karbonat berair 10% -20% (DSA). Membentuk bintik-bintik warna dan
diamati
• Penyemprotan dengan metanol difenilboryloxyethylamine 1% dan
kemudian 5% etanol polyethylene glycol 4000. Sehingga Asam fenolik
muncul sebagai band fluorescent biru
• dengan larutan etanol 5% asam fosfomolybdik dan pemanasan selama 5
menit pada 80oC asam fenolik menjadi berwarna coklat
• Campuran besi (III) klorida 1% dan kalium ferricyanida menghasilkan
warna biru
• Senyawa dengan aktivitas antioksidan divisualisasikan menggunakan
metode penyemprot b-karoten-linoleat
• Beberapa asam fenolik bereaksi dengan reagen asam vanilin-sulfat
membentuk bintik ungu atau ungu muda.
• Beberapa metode deteksi lainnya, misalnya, perlakuan dengan reagen
Cartwright-Roberts atau reagen Folin-Denis