Campus Diadema
Técnicas de Purificação e
Caracterização de Proteínas
Precipitação
Escolha do de proteínas
Lise das Diálise para
material de contaminantes
células retirada de sal
partida com
(NH4)2SO4
1a etapa
cromatográfica
2a etapa
cromatográfica
Proteína pura
Métodos utilizados na lise de
tecidos e células
Liquidificador: quebra tecido conjuntivo e também as células.
Também pode romper organelas.
Sonicação
Ciclos de congelamento/descongelamento
Detergentes
Sobrenadante 1
Centrifugação a
15.000 x g, 10 min
Núcleo e células
não lisadas
Sobrenadante 2
Centrifugação a
Mitocôndrias2
Sobrenadante 100.000 x g, 60 min
e lisossomos
Mitocôndria
Fração solúvel
e lisossomos
do citoplasma
Ribossomos, RE,
Golgi e fragmentos
de membrana
“Salting in” e “Salting Out”
A solubilidade de proteínas é afetada pela concentração de sal de
duas maneiras:
Tipos:
Coluna
Camada fina
Papel
Equipamentos
HPLC (High Pressure Liquid
Chromatography): amostras líquidas
FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography ): proteínas em solução
CG (Cromatógrafo a Gás): amostras
volatilizáveis.
Cromatografia em coluna
Cromatografia de
troca iônica
Separação de
proteínas básicas
(com carga
positiva) e neutras
Separação de
proteínas ácidas
(com carga negativa)
e neutras
Cromatografia de
filtração em gel
Separação de proteínas por
tamanho.
Separação de proteínas
por afinidade com a
coluna.
Alta especificidade.
Métodos de separação de proteínas
2-Eletroforese
Separação baseada na migração de proteínas carregadas
submetidas a um campo elétrico.
Tripsina cliva
proteínas após
resíduos de Arg
ou Lys.
Clivagem de uma
proteína com
Quimiotripsina
Quimiotripsina
cliva proteínas
após resíduos de
aminoácidos
aromáticos.
Clivagem de uma proteína com brometo de
cianogênio
Identificar o
aminoácido
amino-terminal.
Purificar o
peptídeo com n-1
aminoácidos e
reagir novamente
com
fenilisotiocianato.
Funciona bem
com peptídeos
pequenos (até 50
aas).
A espectrofometria utiliza a
propriedade de absorção de luz
característica de uma série de
substâncias.
Raiox X incidem
sobre os átomos de
um cristal de
proteína ,sofrendo
difração.
O padrão de
difração pode ser
usado para
determinar a
posição e a
natureza destes
átomos.
Espectro de Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) Unidimensional de uma globina
RMN utiliza a
propriedade de
spin nuclear
apresentada por
alguns átomos e a
alteração deste
spin quando
submetido a um
campo magnético.
1H e 13N
apresentam spin
nuclear e geram
sinais em um
espectro de RMN
Determinação da
estrutura de uma
proteína por RMN
Bidimensional