Anda di halaman 1dari 36

KROMATOGRAFI

PENDAHULUAN
• Analisis komponen penyusun bahan
pangan penting, tidak hanya mencakup
makronutrien
• Analisis konvensional: lama, tenaga besar,
sering tidak akurat, tidak dapat
mendeteksi pada kadar rendah seperti
ppm
• Teknik kromatografi: terus berkembang
dengan akurasi tinggi
SEJARAH

• Pertama kali digunakan untuk


memisahkan zat warna (chroma)
tanaman
Brief History of Chromatography
• 1903 – Tswett, a Russian botanist
coined the term chromatography. He
passed plant tissue extracts through a
chalk column to separate pigments by
differential adsorption chromatogrpahy
• 1915 R.M Willstatter, German Chemist
win Nobel Prize for similar experiement
• 1922 L.S Palmer, American scientist
used Tswett’s techniques on various
natural products
• 1931 Richard Kuhn used
chromatography to separate isomers
oh polyene pigments; this is the first
known acceptance of chromatographic
methods

http://www.chemgeo.uni-hd.de/texte/kuhn.html
DEFINISI

• Teknik pemisahan yang dilakukan


dengan memanipulasi sifat fisik dari
zat-zat penyusun suatu campuran

• Tidak ada dua zat yang mempunyai


sifat fisik yang sama sehingga
pemisahan untuk zat yang serupa
masih mungkin untuk dilakukan
SIFAT FISIK YANG
DIMANIPULASI

• Kecenderungan zat untuk larut dalam


suatu cairan
• Kecenderungan zat untuk teradsorpsi
pada butir zat padat yang halus dengan
permukaan luas (adsorben)
• Kecenderungan zat untuk menguap
ISTILAH PENTING

1. Polaritas
2. Partisi
3. Adsorpsi
4. Jenis fase: fase stasioner dan
fase mobil
1. POLARITAS
• Penting untuk kromatografi
• Menunjukkan adanya pemisahan kutub muatan
positif dan negatif dari suatu molekul sebagai
akibat terbentuk konfigurasi tertentu dari atom-
atom penyusunnya
• Molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul lain
yang mempunyai polaritas
• Tingkat pemisahan dari molekul-molekul
tersebut menentukan polaritas dan daya
tariknya
dalam kromatografi
Polaritas digunakan sebagai petunjuk sifat:
• Pelarut/solven
• Adsorben
• Zat yang dipisahkan/solut

PRINSIP LIKE DISSOLVES LIKE


• Pelarut polar cenderung melarutkan solut polar
• Adsorben polar cenderung mengadsorbsi solut
polar
POLARITAS RELATIF BERBAGAI JENIS PELARUT

KONSTANTA DIELEKTRIK JENIS PELARUT


1,89 Petroleum ringan (petroleum eter,
heksana, heptana)
2,023 Sikloheksana
2,238 Karbon tetraklorida, trikloroetilen, toluena
2,284 Benzena, diklorometana
4,34 Etil eter
4,806 Kloroform
6,02 Etil asetat
20,70 Aseton, n-propanol
24,30 Etanol
33,62 Metanol
80,37 Air
Polaritas pelarut
• Sebanding dengan konstanta dielektrik zat
pelarut
2/3. PARTISI DAN ADSORBSI

• Pemisahan dengan proses partisi dan


adsorbsi dipengaruhi oleh perbedaan
polaritas solut yang dipisahkan
• Polaritas merupakan faktor yang
menentukan daya larut (kemampuan
partisi) dan adsorbsi solut
PARTISI
• Proses partisi tergantung dari daya larut
solut dalam dua macam cairan
• Peka terhadap perbedaan BM solut
• Zat yang terdiri dari satu seri deret
homolog paling baik dipisahkan dengan
kromatografi partisi
• Misal: pemisahan berbagai jenis asam
amino, asam lemak, gula
ADSORBSI
• Peka terhadap bentuk stereometri dari solut
yang dipisahkan
• Banyaknya solut yang dapat diadsorbsi pada
permukaan adosrben tergantung dari konfigurasi
solut
• Kemampuan untuk diadsorbsi menentukan
kemudahan solut untuk dipisahkan dengan
kromatografi adsorbsi
• Cocok untuk memisahkan campuran solut yang
serupa tetapi mempunyai perbedaan bentuk
sterometrik
JENIS-JENIS
KROMATOGRAFI
• Berdasarkan prinsip kerja: partisi dan
adsorpsi

JENIS
• Kromatografi lapis tipis (TLC)
• Kromatografi kolom: HPLC, GLC,
penukar ion, gel filtrasi
Kromatografi berdasar
B.PEMBAGIAN atas proses
KROMATOGRAFI
pemisahannya :

a. Kromatografi adsorbsi
b. Kromatografi partisi
c. Kromatografi pasangan ion
d. Kromatografi penukar ion
e. Kromatografi eksklusif
f. Kromatografi afinitas,

16
Pembagian berdasar alat
Menurut alat yang digunakan terdiri dari 3 alat
yang selalu dapat di kembangkan perleng
kapannya ialah:
a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat juga dikenal
dengan thin layer chromatography (TLC). Dan
kromatografi Kertas
b. Kromatografi Gas, jenis kromatografi kolom yang
menggunakan fase gerak gas.(GC)
c. Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT, dan
berasal dari terjemahan High Perfomance Liquid
Chromatograpfay atau HPLC. Kromatografi ini
termasuk kromatografi kolom yang fese geraknya
berupa cairan dan dialirkan berdasar kekuatan
dari tekanan yang diberikan.

17
Menurut Willard et at, (1989), pembagian
kromatografi dapat dibuat bagan sebagai berikut:

Gas
Gas Cir padat
GLC GSC

18
Keterngan

: GLC = Gas Liquid Chromatography


GSC = Gas Solid Chromatography
IEC = Ion Exchange Chromatography
EC = Eclusive Chromatography
LLC = Liquid-Liquid Chromatography
LSC = Liquid-Solid Chromatography
BPC = Bonded Phase Chromatography
PIC = Pair Ions Chromatography

19
• Pembagian diatas berdasar jenis fase, ialah
cair dan gas, sedangkan dalam pembagaian
kedua seperti penukar ion dan eklusif serta
pasangan ion hanya mengetengahkan salah
satu fase diam,
• Willard menerangkan bahwa kedua
kromatografi penukar ion dan eklusif merupakan
kromatografi yang berdasar pada interakasi
antara linarut dan fase diam.
• Seperti pembagian kromatografi atas dasar
pemisahaan, sebenamya kromatografi
dibedakan menjadi 2 ialah: adsorbsi, dan
partisi yang dapat terjadi baik dalam
kromatografi gas maupun kromatografi cair.
20
• Kromatografi eksklusif merupakan kromatografi
yang pemisahannya atas dasar ukuran molekul
linarut, utamanya pada molekul yang besar,
sehingga dinamakan pula kromatografi filtrasi.

• Pada kromatografi filtrasi dapat pula terjadi pada


kromatogarfi gas tetapi dengan ukuran molekul
yang kecil disebut moleculer shiever

• Sehingga terdapat teori pemisahan dalam


kromatografi
• Teori tersebut perlu dibahas terpisah sesuai
dengan topik dan aplikasinya.
21
C.TEORI PEMISAHAN
Seperti telah dijelaskan bahwa kromatografi adalah alat
pemisahan campuran senyawa kimia, karena itu perlu
diketahui teori dan mekanisme dari berbagai
pemisahan.

1. Pemisahan Adsorpsi

 Peristiwa adsorpsi oleh fase diam terhadap fase gerak dan


linarut selalu terjadi kompetitif
 Kemampuan fase diam mengadsorpsi keduanya sangat
tergantung pada topografi gugus aktif yang terdapat
pada masing -masing komponen.
 Fase diam dari silica yang mempunyai gugas hidoksil dari
silanol (Si-OH) dapat terjadi interaksi dengan gugus pada
linarut maupun pada fase gerak.

22
• Peristiwa adsorbsi umumnya terjadi pada
kromatografi padat cair (liquid solid
chromatography, atau LSC, terjadi pada KLT).
• Dapat pula terjadi pada Gas solid
chromatography atau Kromatografi gas (KG)
yang berinteraksi antara fase diam dan linarutnya.
• Fase gerak pada kromatografi gas, tidak
mempunyai gugus aktif yang dapat berinteraksi
dengan fase diam. Rumus kompetitif itu sebagai
berikut:

23
Xm + nSads  Xads + nSm (1.1)
Xm dan Xads adalah linarut dalam fase gerak (m) dan
fase diam (ads), sedangkan Sm dan Sads adalah fase
gerak yang mengalami adsorpsi.
Berdasar persamaan tersebut tempat linarut pada
fase diam dapat digantikan oleh fase gerak atau
sebaliknya.
Bila senyawa X mempunyai ikatan yang kuat
terhadap penjerap (ads), maka X akan lama
tertambat pada ads. Pada keadaan seimbang
dirumuskan sebagai berikut:
 (XAds)(Sm)n
KD =  (2.1)
(Xm)(Sads)n

24
Rumus Distribusi
• Rumus 2 dapat disederhanakan menjadi:
• KD =CS/CM (3.1)

CS menyatakan kadar linarut dalam fase diam


(stationair phase), dan CM kadar linarut dalam
fase gerak (mobile phase).
 Persamaan diatas menunjukkan bahwa linarut X
lebih sedidik berinteraksi dengan fase diam
karena indeknya lebih kecil dan jumlah dalam
masing-masing fase juga sangat kecil.
Dengan pedoman tersebut bcrarti kadar linarut
dalam fase diam selalu lebih kecil dari kadar
linarut dalam fase gerak.
25
Faktor yang berpengruh padaAdsorpsi
Dalam kromatografi selalu menggunakan pedoman
umum seperti ini, sehingga harga KD selalu lebih kecil
dari 1, Tetapi mungkin dapat terjadi yang sebaliknya.
Dasar tersebut yang menyebabkan terjadinya
pemisahan. Adsorpsi linarut oleh fase diam sangat
tergan-tung pada:
a. Struktur kimia linarut atau adanya gugus aktif yang
ada
b. Ukuran partikel fase diam, makin kecil ukuran
partikel fase diam makin luas permukaannya
sehingga kontak dengan linarut makin luas.
c. Kelarutan linarut dalam fase gerak, makin mudah
larut linarut dalam fase gerak, linarut makin mudah
lepas dari fase diam.
26
Interaksi Fase Diam dan Analit

• d. Kemampuan interaksi (isotermik) yang


terjadi antara fasediam dan fase gerak.
Contoh interaksi antara beberapa senyawa
aromatik (analit ) dengan silica(fase
diam)

27

28
• Ikatan hidrogen yang terbentuk dari para
dihidroksi benzen paling kuat karena jarak gugus
OH sama dengan jarak SiOH.
• Bentuk ikatan tersebut menunjukka n bahwa para
dihidroksi benzen membentuk ikatan pada ke dua
sisi dengan silanol.
• Hal tersebut juga terjadi pada gugus yang lain
seperti nitro, amina, karena gugus yang terdapat
pada senyawa tersebut sebagai pemberi atau
penerima elekron maupun proton ( atom N, 0, P
dan S) maka kejadiannya dapat dilihat pada
gambar slide 25.
• Puncak hasil analisis dengan HPLC atau bercak
yang terjadi pada analisis dengan KLT untuk
dihidroksi benzen sangat berbeda dengan yang
lain.
29
• Puncak dan bercak.
Contoh

Campuran sebelum elusi


30
Keterangan
• Puncak pada KCKT p-dihidroksi benzen
paling lama tertahan dalam kolom dengan
fase diam silica gel. Karena iktannya paling
kuat.
• Bercak pada KLT p-dihidroksi benzin paling
pendek migrasinya, karena ikatan dengan
fase diam silica paling kuat.
Makin dekat gugus hidroksil, ialah meta
dihidroksi dan o – dihidroksi benzen paling
mudah terelusi oleh pelarut, tetap ikatan
adsorbsinya dengan silika makin lemah,

31
Penggolongan tipe adsorbsi isotermik
Peristiwa adsorbsi isotermik dapat digolongkan
dalam beberapa tipe.
a.Tipe konkap,
terjadi bila mula-mula linarut tidak kuat
interaksinya. tetapi kemudian menjadi lebih
kuat sehingga terikat lama pada fase diam.
berarti K < 1
b.Tipe normal (linier),
ikatan yang terjadi pada setiap saat panggah
atau tetap. Sehingga berupa garis lurus dan K =
1.
c.Tipe konvek,
adsorpsi mula-mula terikat dengan kuat oleh
fese diam, tetapi makin lama makin lemah
sehingga bentuk kurvanya menjadi konvek atau
harga K>1

32
•Puncak berekor

Tipe a dan b tersebut yang sering


menyebabkan terjadinya pelebaran puncak
lihat gambar 3.2
Cntoh gambar adsorbsi isotermik
Gambar:

34
a. Jenis fase diam
• Fase diam untuk kromatografi adsorbsi yang paling
banyak digunakan adalah silica gel, hampir semua
bahan kimia dapat dipisahkan secara kromatografi
menggunakan fase diam silica gel.
• Partikel fase diam mempunyai bentuk dan ukuran
yang berbeda. Ukuran makin kecil akan makin
memperluas pcrmukaan fase diam, dan memperluas
pula gugus aktif dan fase diam yang aktif
berhubungan dengan linarut
• Bentuk dengan pori yang dalam, bila pori tersebut
sangat banyak akan menaikkan harga K, yang jauh
lebih besar dari 1 dan menimbulkan garis kurva
adsorbsi isotermik yang konkaf

35
• Makin dangkal pori yang ada, makin efisien untuk
pemisahan.dan kromatografi model sekarang digunakan
yang paling efisien.
• Dianjurkan untuk memilih fase diam dengan pedoman
sebagai berikut:

1.Fase diam yang bentuk polikuler (pori yang dalam) akan


menurunkan efisiensi, tetapi menaikkan
kapasitasnya.
2.Bentuk pelikuler tak berporus umumnya dibuat packing
dengan cara kering
3.Bentuk mikroporus, dikepak secara basah (adonan
atauslurry, permukaan jadi luas menambah harga K

36