Anda di halaman 1dari 36

Plant Recycling

for Molecular Biofarming


to Produce Recombinant
Anti-Cancer mAb
KELOMPOK 03
BRIAN WIRAWAN
DAMAI KASIH L.
HASNA APRILIA
MUHAMMAD AFIF
STEFANI
OUTLINE
LATAR BELAKANG

KANKER KOLON
ANTIGEN DAN ETIOLOGI
KANKER KOLON
METODE PENGEMBANGAN ANTIBODI
DARI SEDIAAN TANAMAN

HASIL ANALISIS
LATAR BELAKANG
Latar Belakang
• Biofarming (Molecular pharming)  Modifikasi
genetik tanaman atau hewan untuk memproduksi
obat-obatan.
• Tumbuhan  protein rekombinan  antibodi,
vaksin, produk darah manusia, hormon, dan ZPT.
• Kecepatan menghasilkan biomassa dari tumbuhan
sangat penting untuk menghemat waktu produksi
protein rekombinan.
• Diperlukan waktu lebih dari 14 minggu untuk
pertumbuhan total tanaman tembakau dari sejak
awal ditabur
Latar Belakang (2)
• Mekanisme-mekanisme fisiologis yang bertanggung jawab
untuk pertumbuhan tunas lateral yang pesat tanpa
berhubungan dengan peningkatan pertumbuhan akar, dapat
meningkatkan akumulasi biomassa (Vysotskaya, 2005).
• Pemotongan tunas apikal/terminal dapat menginduksi tunas
lateral untuk menghilangkan dominansi apikal.
• Kecepatan pertumbuhan tunas tanaman dapat ditingkatkan
dengan menurunkan rasio tunas / akar.
• Bagaimana efek pemotongan tangkai untuk menghilangkan
dominasi apikal pada tingkat pertumbuhan tunas ?
• Apakah pertumbuhan tunas sekunder akan berguna sebagai
sistem daur ulang tanaman untuk mendapatkan peningkatan
biomassa sehingga produksi protein mAb anti-kanker
rekombinan juga meningkat?
Kanker Kolon / Kolorektal
KANKER
KOLON/KOLOREKTAL (KKR)
• Kanker kolon atau yang lebih dikenal dengan kanker
kolorektal merupakan keganasan yang berasal dari
jaringan usus besar, terdiri dari kolon atau rektum.
Kanker kolorektal (KKR) adalah kanker tertiga
terbanyak dan merupakan kanker penyebab
kematian kedua terbanyak pada pria dan wanita di
Amerika Serikat. Risiko kanker kolorektal adalah 5
persen, berarti 1 dari 20 orang memiliki risiko kanker
kolorektal di mana pria lebih berisiko dibandingkan
wanita.
Penyebab KKR

• Faktor risiko, di mana pernah menjadi penderita


kanker kolon sebelumnya
• Faktor genetik melalui chromosomal instability
(CIN), dan microsatellite instability (MIN)
Skrining KKR

• Colok dubur
• Pemeriksaan Guaiac-based fecal occult blood test
(gFOBTs), fecal immunochemical tests (FITs) dan
pemeriksaan feses untuk exfoliated DNA.  Yang
paling sering digunakan dalam pendeteksian kanker
kolon
• Pemeriksaan endoskopi
Jenis KKR yang Diturunkan

a. Familial Adenomatus Polyposis


b. MUTYH-Associated Polyposis
c. Peutz-Jeghers Syndrome
d. Serrated Polyposis Syndrome
e. Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer
f. Sporadic Colon Cancer
Antigen Kanker
Metode Pengembangan
Antibodi Dari Sediaan
Tanaman
Material Tumbuhan
dan Kultivasi 40 bibit
tembakau
tembakau
transgenik T2,
dengan
tanaman
keturunan
anti-kanker
kolorektal
mAb (mAbP
CO17-1A)

Steam-
sterilized soil
mixture
Amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR)
dari DNA Genomik Daun dan Batang pada
Tanaman 0, 1, dan 2 Siklus
DNA genomik diisolasi dari kira-kira 100 mg jaringan daun dan batang
tanaman (0, 1, dan 2 siklus). Hasil ekstraksi DNA kemudian diamplifikasi
menggunakan PCR untuk memastikan keberadaan gen untuk rantai
padat mAb CO17-1A (HC; 1,471 bp) dan rantai ringan (LC; 764 bp),
dengan menggunakan primer langsung dan terbalik sebagai berikut:
HC forward primer, 5′-GCGAATTCATGGAA TGGAGCAGAGTCTTTAT C-3′;
HC reverse primer, 5′-GATTA ATCGATTTTACCCGGAGTCCG-3′;
LC forward primer, 5′-GC CTCGAGATGGGCATCAAGATGGAATCACAG-3′;
LC reverse primer, 5′-GAGGTACCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC- 3′.
Analisis Wester Blot
PCR analysis to confirm the existence of HC and LC genes
in top, middle, and basal portions of both the leaves and
stems of transgenic plant (0, 1, and 2 cycles).
Western blot analysis to confirm the mAbP CO17-1A HC
and LC expression in the leaves and stems of transgenic
plants through 0, 1, and 2 cycles.
Purifikasi Rekombinan mAbP CO17-1AK dari
Daun dan Batang Tanaman Setiap Siklus
Sentrifugasi pada Supernatan
Homogenisasi di es 8,800 × g selama disentrifugasi pada
dalam buffer 30 menit pada 10,200 × g selama
ekstraksi suhu 4◦C 30 menit

pH supernatan Total protein terlarut


Pellet kemudian di
dinetralkan dengan akan mengendap
suspensi ulang
menambah 3 M Tris- dengan amonium
untuk 1/10 volume
HCl sulfat setelah
buffer ekstraksi
semalam diinkubasi

Protein mAbP CO17-1A


Protein yang telah
Larutan yang diperoleh dimurnikan
dimurnikan
disentrifugasi pada menggunakan protein
divisualisasikan dengan
10,200 × g selama 30 A Sepharose 4 Fast
menggunakan SDS-
min dalam suhu 4◦C Flow. Konsentrasi
PAGE. Aliquot disimpan
diukur menggunakan
pada suhu −80◦C
nano drop
Analisis Susunan Glikan

Sampel protein mAbP CO17-1A yang telah dimurnikan diberikan dua kali
perlakuan dengan 1 μL pepsin dalam inkubator pada suhu 37◦C selama 16 untuk
mencerna protein menjadi glikopeptida. Glikopeptida kemudian diambil. Enzim
glikan N-glycosidase (PNGase) A ditambahkan ke glikopeptida untuk melepaskan
N-glycans, dan campuran tersebut diinkubasi semalaman pada suhu 37◦C. Glikan
yang telah dimurnikan adalah 2-aminobenzamide .
Analisis Resonansi Permukaan
Plasmon
Analisis surface plasmon resonance (SPR) dilakukan
untuk memastikan afinitas atau daya tarik menari dari
mAbP CO17-1A ke antigen GA733 menggunakan GLC chip
pada XPR36. Protein GA733 diimobilikasi pada GLC chip,
dan buffer asam dengan pH 6.0 dialirkan pada
permukaan biochip dengan laju alir sebegsar 50 μL/min.
Salah satu mikrogram mAbP CO17-1A yang telah
dimurnikan, dari daun dan batang (sampel 0, 1, and 2
siklus), dilarutkan dalam 300 μL of 1× PBS, lalu 300 μL ini
digunakan untuk mengimobilisasi reseptor pada laju alir
50 μL/min dalam suhu 25◦C dan pH 6.0. Setelah setiap
pengukuran, permukaan dari sensor chip diregenerasi
menggunakan phosphoric acid buffer.
HASIL ANALISIS
Induksi dan Pertumbuhan Tunas Aksilar
oleh Batang Bagian Bawah
• Transformasi tanaman tembakau yang
dimediasi dengan Agrobacterium dilakukan
untuk menghasilkan tanaman transgenik yang
mengekspresikan anti kanker kolorektal mAb
CO17-1A.
• Tunas lateral diinduksi setelah
mempertahankan sistem akar dengan
memotong batang bawah tanaman transgenik
yang mengekspresikan anti kanker kolorektal
mAb. Hanya satu tunas lateral dibiarkan
tumbuh sampai sebelum pembentukan organ
bunga. Pemotongan batang bawah dilakukan
dalam 2 siklus). Namun, periode pertumbuhan
tunas aksilar ke tahap berbunga dari batang
potong adalah 30 dan 35 hari dalam 1 dan 2
siklus .
• Secara keseluruhan, periode pertumbuhan
tunas lateral dalam 1 dan 2 siklus hampir tiga
kali lebih pendek dibandingkan dengan tunas
primer dari semai (siklus 0).
Keberadaan mAb CO17-1A pada Gen
HC DAN LC dalam 0, 1, dan 2 Siklus
Tanaman

• Analisis PCR dilakukan untuk


mengkonfirmasi keberadaan
gen HC (Heavy Chains) dan LC
(Light Chains) dari mAb CO17-
1A pada daun dan jaringan
induk di bagian atas, tengah,
dan pangkal batang dalam 0, 1,
dan 2 siklus (Gambar 1C).
• Gen HC dan LC ada di semua
bagian daun dan jaringan
batang tunas lateral di semua
siklus.
Tingkat Protein HC dan LC mAb CO17-1A
dalam Jaringan Daun dan Batang Bagian Atas,
Tengah yang Melalui Daur Ulang
• Perubahan kadar protein HC dan LC di atas, tengah, dan daun
basal dan batang dalam 0, 1, dan 2 siklus diselidiki oleh Western
Blotting. Di bagian atas daun, tingkat HC sedikit meningkat
dengan siklus. Tingkat LC stabil selama siklus. Dalam jaringan
induk, kadar HC dan LC stabil selama siklus.
• Pada batang basal, tingkat HC sedikit menurun selama siklus.
Secara keseluruhan, kadar protein HC dan LC sama pada sampel
dari semua bagian batang melalui siklus.
Analisis Glycan mAbp CO17-1A yang
Dimurnikan dari Daun dan Batang pada 0, 1,
dan 2, Siklus Tanaman
• N-glikan mAbP CO17-1A yang dimurnikan dari daun dan
batang tanaman pada siklus 0, 1, dan 2 dianalisis dengan
HPLC. Pola glikosilasi dianalisis dalam daun dan batang (0, 1,
dan 2 siklus) jaringan. Profil glikan daun dan batang dari
tanaman (0, 1 dan 2 siklus) adalah serupa dan menunjukkan
profil struktur gncanosa tipe mannose yang tinggi. Persentase
oligomannose glycan di daun dan batang adalah 15 dan 13,7-
14,9. Profil struktur glikan mAbP CO17-1A pada 0, 1, dan 2
siklus daun dan batang tanaman serupa.
Analisis SPR mAb CO17-1A yang
Dimurnikan dari Daun dan Batang pada 0,
1,dan 2 Siklus Tanaman

• Dilakukan untuk mengidentifikasi HC dan LC dari dimurnikan


mAb CO17-1A di daun dan batang tanaman sampel yang
diperoleh dalam setiap siklus (0, 1, dan 2). Hasil pemurnian
mAb CO17-1A dari siklus tanaman 0, 1, dan 2 menunjukkan
ukuran band yang sama untuk HC dan LC. Ekspresi dan
kemurnian mAb CO17-1A dalam batang juga dikonfirmasi
dalam siklus tanaman 0, 1, dan 2. Semua mAbP CO17-1A
dimurnikan dari jaringan daun dan batang yang dikumpulkan
dalam siklus yang berbeda menunjukkan interaksi yang
relatif sama dengan antigen GA733-Fc menggunakan SPR.
• Ikatan pengikatan mAb CO17-1A dimurnikan dari sampel
daun dan batang yang dikumpulkan dari tanaman siklus
yang berbeda adalah serupa kecuali untuk 2 siklus di mana
mAb CO17-1A dimurnikan dari batang menunjukkan afinitas
sedikit lebih tinggi untuk antigen daripada mAb CO17-1A
yang dimurnikan dari daun. Ketika aktivitas pengikatan mAb
CO17-1A dimurnikan dari daun dan sampel batang
dibandingkan di antara siklus, 1 siklus menunjukkan afinitas
yang sedikit lebih rendah daripada 0 dan 2 siklus .Secara
umum, puncak mAb CO17-1A dari kedua daun dan sampel
batang serupa antara 0 dan 2 siklus.
KESIMPULAN
• Kanker kolon sebagian besar dapat diturunkan melalui
genetik.
• Antigen merupakan jenis protein yang kadarnya dapat
menentukan perkembangan sel kanker pada pengidap kanker.
• Proses kultivasi tanaman tembakau dilakukan untuk siklus
primer (0 siklus), sekunder (2 siklus), dan tersier (3 siklus),
dimana pada setiap siklus diberi suatu perlakuan.
• Metode yang dilakukan untuk mendapatkan tanaan produsen
antibodi terdiri atas kultivasi, amplifikasi PCR, analisis Western
Blot, purifikasi rekombinan, analisis susunan glikan, dan
analisis resonansi permukaan plasmon.
• Transformasi tembakau menjadi tanaman transgenik anti
kanker kolorektal dapat dilakukan karena di dalam antibodi
tersebut terdapat gen HP dan LC yang dapat diidentifikasi
dengan analisis PCR, analisis SPR, dan Western Blotting.
DAFTAR PUSTAKA
Bogaert, J. and Prenen, H. (2014). Molecular genetics of
colorectal cancer. Ann Gastroenterol, [online] 27(1).
Available at:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3959
535/ [Accessed 7 May 2018].
Bunawan, N. and Simadibrata, M. (2017). The Role of Fecal
M2-Pyruvate Kinase (M2-PK) in Colorectal Cancer
Screening. The Indonesian Journal of Gastroenterology
Hepatology and Digestive Endoscopy, [online] 18(1).
Available at:
https://media.neliti.com/media/publications/178252-
ID-none.pdf [Accessed 7 May 2018].
Komite Penanggulangan Kanker Nasional (2017). Kanker
Kolorektal. Jakarta: Kementerian Kesehatan.
Song, I. and Kim, J. (2016). Plant Recycling for Molecular
Biofarming to Produce Recombinant Anti-Cancer mAb.
Seoul: Chung-Ang University.
TERIMA KASIH