Genetically Modified Organism

KELOMPOK 8 A
ANGGA GIAN PRATAMA 01311640000053
AVIANITA PUJI R. 01311640000007
BRILLIANCY P.P 01311640000027
RAFIKA T.P 01311640000069
GMO SEARCH
Contents 1 Pengertian 4 Contoh

2 Klasifikasi 5 Dampak
Metoode
3 6 Study kasus
Pembuatan

3
 GMO
Genetically Modified Organism
 Rekayasa genetika pada dasarnya adalah
seperangkat teknik yang digunakan untuk
memanipulasi komponen genetik, yakni
PENGERTIAN DNA genom atau gen yang dapat

GMO dilakukan dalam satu sel atau mahluk

hidup (organisme), bahkan dari satu
mahluk hidup ke mahluk hidup lain yang
berbeda jenisnya (Asaye et al., 2014).
 Mahluk hidup yang materi genetiknya
telah dimanipulasi secara artifisial di
laboratorium melalui rekayasa genetika
PENGERTIAN disebut dengan mahluk hidup transgenic
GMO atau rekayasa genetika mahluk hidup
yang memiliki sifat unggul dibandingkan
dengan mahluk hidup asalnya
(Marinho et al., 2012).
 GMO

Menurut Thomas J Schoenbaum, GMO merupakan

organisme yang hidup dari kombinasi baru suatu
meteri genetik sebagai aplikasi dari bioteknologi.
PENGERTIAN Menurut World Health Organization (WHO), GMO

GMO adalah suatu organisme yang DNA-nya telah

dirubah secara tidak alami melalui suatu teknologi
sehingga gen yang dimaksud dapat ditransfer dari
satu organisme ke organisme lain dan juga antara
organisme yang berbeda spesies.
(Mahrus, 2014)
 Herbert Boyer Stanley Cohen

(Sugianto, 2017)

Herbert Boyer and Stanley Cohen made the first genetically modified organism (GMO) in 1973. They took a gene from a
bacterium that provided resistance to the antibiotic kanamycin, inserted it into a plasmid and then induced another bacteria
to uptake the plasmid. The bacteria was then able to survive in the presence of kanamycin.
TUJUAN Tujuan utama pengembangan GMO adalah untuk

GMO mengatasi berbagai masalah kekurangan pangan

yang dihadapi penduduk dunia yang tidak mampu
dipecahkan secara konvensional, karena
pertumbuhan penduduk yang begitu cepat.

10
Klasifikasi
 Klasifikasi GMO
Generasi Pertama
satu sifat, tanaman mengandung elemen transgenik yang
umum digunakan, seperti cauliflower mosaic virus (CaMV),
35Spromoter (CaMV35S-P), aminoglycoside
30phosphotransferase gene (nptII),phosphinothricin
acetyltransferase gene(pat/bar), 5-enolpyruvylshikimate 3-
phosphate(CP4-epsp) gene, nopaline synthase promoter(nos-
P), danterminator (nos-T). (Lu et al.,2010).
Generasi Kedua
hasil persilangan antara generasi pertama yang komersial.
GMO
(Lin & Pan, 2016)
Namun demikian, generasi kedua memiliki dua masalah yang
besar yang muncul dalam mendeteksi kumpulan sifat pada
tanaman transgenik, yaitu: analisis gen yang mendalam mungkin
dibutuhkan untuk membedakan antara sifat tanaman yang
menumpuk dan yang tidak, dan membedakan dari campuran
peristiwa yang berasal dari single stack trait hanya mampu
dideteksi dengan biji atau tanaman tunggal.
Generasi Ketiga
Pada generasi ketiga, tanaman disebut sebagai near-
intragenics yang elemen transgenic tidak digunakan dalam
tanaman transgenik lain. Transgenik yang dikonstruksi berasal
dari inang dan telah mengalami rekombinasi atau modifikasi
sehingga lebih sulit untuk dideteksi dibandingkan dengan
generasi pertama ataupun kedua.
Generasi keempat
tanaman yang digolongkan dalam intragenik dan cisgenik. Jika
gen donor dan seluruh regulator sequence transgenic dimiliki
oleh spesies tanaman yang sama atau dimiliki oleh spesies inang
yang mampu disilangkan, maka akan menghasilkan cisgenik.
Sementara itu, pada intragenik, cassettesgene insert
mengandung sekuens genetic spesifik yang berasal dari tanaman
yang memiliki gene pool yang sama.
Metode Pembuatan GMO
 Transfer Gen
untuk mendapatkan tanaman dengan komposisi genetik yang baru.
Transfer gen dapat dilakukan dengan metode transfer gen langsung atau
melalui vektor. Metode transfer gen melalui vektor dapat dilakukan dengan vektor
A. tumefaciens
Transformasi genetik memerlukan gen penanda untuk pengenalan sel-sel
yang tertransformasi.
dua tipe yaitu penanda :
•Penanda selectable : kanamisin dan higromisin.
•Penanda screenable:gen yang mengkode produk berupa enzim yang aktivitasnya
dapat dengan mudah di assay
The Power of PowerPoint | thepopp.com 15
 VirDl/D2 mengenali
Fosforilasi VirA
urutan border 25 pb dan
pada VirG Transfer
Ekspresi gen VirA mendeteksi menghasilkan pembelahan
kemudian intermediet
diperantarai oleh Asetosiringone untaian tunggal
menyebabkan dimulai dengan
protein VirA dan mengakibatkan endonukleolitik pada
aktivasi menggenerasikan
VirG autofosforilasi untaian bawah setiap
transkripsi gen T-strand
border untuk
vir
menghasilkan T-strand

VirD2 tetap terkait erat

T-complex harus keluar dari
sel bakteri dan masuk
T-strand menjadi
kedaam tanaman Setelah
terintegrasi ke
berada di dalam sel tanaman,
dalam kromosom
T-complex ditargetkan ke inti
tanaman
sel tanaman dan melintasi
membran nukleus
dengan ujung 5 'dari T-
VirE2 mengikat
strand. VirD2 pada ujung
dengan erat yang
5' memberikan karakter
berarti bahwa T-
polar pada T-complex
strand akan
yang dapat menjamin
benar-benar
bahwa ujung 5' adalah
dilindungi
ujung terdepan dalam
tahap berikutnya.

17
 Tahapan Penyisipan Gen

Ti-plasmid yang terdapat pada bakteri

agrobacterium dikeluarkan dari sel bakteri
agrobacterium kemudian dipotong dengan
menggunakan enzim endonuclease
restriksi.

Isolasi dna pengkode protein (gen)

yang kita inginkan dari organisme
tertentu

Sisipkan gen yang kita inginkan tersebut pada

plasmid dan rekatkan dengan enzim DNA
ligase dan dilanjutkan Masukkan kembali
plasmid yang sudah disisipi gen ke dalam 18
bakteri agrobacterium
 Plasmid yang sudah disisipi gen akan
terduplikasi pada bakteri agrobaterium
Selanjutnya , bakteri akan masuk ke dalam
sel tanaman dan mentransfer gen

Kemudian, sel tanaman akan membelah.

Tiap-tiap sel anak akan memperoleh gen
baru dalam kromosom dari sel tanaman
dan membentuk sifat/karakteristik yang
baru (yang sesuai dengan gen yang
disisipkan).

19
20
Konstruk gen yang diintroduksi ke tanaman mengandung 3 elemen, yaitu

Promoter Gen Terminator

yang berfungsi untuk yang diintroduksi yang yaitu untuk menghentikan signal

mengaktifkan gen yang mengekspresikan sifat yang pembacaan dari sekuen gen yang
diintroduksi dalam proses
diintroduksikan, diinginkan
pembentukan protein
(Dhivya.,Et.al.,2016)
23
 Cara untuk mendeteksi gen yang sudah tersisipkan dalam tanaman Teknik
molekuler yang biasa digunakan untuk deteksi gen asing pada tanaman hasil
tranformasi genetika adalah:

1. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Teknik PCR dapat digunakan untuk mendeteksi
keberadaan suatu gen sisipan pada tanaman hasil
transformasi. Teknik ini sangat praktis dan mudah
dilakukan, karena hanya membutuhkan jumlah DNA
yang sedikit sehingga tes PCR terhadap tanaman
transgenik dapat dilakukan secara dini, yaitu pada
tahap kalus atau planlet
2. hibridisasi Southern Blot
Relatif lebih lama dan mahal pelaksanaannya, karena
membutuhkan sampel DNA yang banyak, bahan kimia
yang mahal, dan proses yang panjang. Tetapi dengan
analisis ini dapat diketahui pola integrasi dan jumlah
kopi gen asing yang disisipkan (Herman dkk., 2001).
25
Aplikasi dan Contoh produk GMO
 Biji Terminator
Genetic Use Restriction Technologies – GURTs merupakan salah
satu metode yang memungkinkan biji dapat dikendalikan ekspresi
gennya melalui proses genetik yang dipicu oleh faktor
penginduksi.
Penerapan positif dari GURTs ini memungkinkan petani untuk
dapat mengkontrol sifat-sifat unggulan dari tanaman mereka
dengan memberikan perlakuan khusus.

Namun beberapa perusahaan menggunakan teknologi ini untuk

membatasi penggunaan gen yang tidak perlu dalam bidang
pertanian untuk menjaga hak paten.

Mekanisme Biji Terminator

Teknologi GURTs dalam biji terminator pada umumnya menggunakan 3 gabungan gen asing, yaitu:
•Gen Protein Sitotoksik (Gen Terminator), gen yang dibawah kontrol gen LEA (Late Embriogenesis Abundant). Pada bagian sebelum Gen terminator ini
terdapat DNA spacer(Bloking site) yang diapit oleh situs pemotongan spesifik.
•Gen rekombinase spesifik (Cre), yang akan mengenali situs pemotongan yang mengapit DNA Spacer.
•Gen Tn10 tet repressor, berfungsi sebagai pengontrol bagian promoter gen rekombinase spesifik. 27
 Contoh tanaman transgenik

Golden rice
Proses rekayasa genetika ini bertujuan untuk menghasilkan sejumlah besar beta karoten, suatu provitamin yang oleh tubuh dikonversi menjadi vitamin A.
Perkiraan di tahun 2004 menunjukkan bahwa 500.000 anak-anak didunia akan menjadi buta karena kekurangan vitamin A. Solusinya adalah dengan
menambahkan nutrisi pada suplai makanan akan efisien dan efektif untuk mengatasi permasalahan tersebut (endik dkk., 2017).
Rekayasa genetika merupakan metode yang digunakan untuk produk golden rice. Hal ini disebabkan karena tidak ada plasma nutfah padi yang mampu
untuk mensintesis karotenoid. Pendekatan transgenic dapat dilakukan karena adanya perkembangan teknologi transformasi dengan agrobacterium dan
ketersediaan informasi molekuler biosintesis karatenoid yang lengkap pada bakteri dan tanaman. Dengan adanya informasi tersebut terdapat berbagai
pilihan cdna. Produksi prototype golden rice dengan menggunakan galur padi japonica (taipe 309), teknik transformasi menggunakan agrobacterium dan
beberapa gen penghasil beta karoten tanaman daffodil hingga bakteri
 Contoh Produk GMO

Ikan Nila Transgenik Ikan zebra (Glofish) Golden Rice

29
 Pada dasarnya produk-produk GMO sangat banyak dan
tersebar di berbagai bidang (pertanian, farmasi dan
kedokteran, industri, dan lingkungan) (Mae-Wan Ho, 2008).
Contoh Produk Contoh dari produk GMO yaitu :

GMO  Hewan transgenik

Contoh : Ikan Nila Transgenik (mBtiGH), Ikan zebra
(Glofish), dan Sapi Transgenik.
 Tanaman transgenik
Contoh : Golden Rice, Padi tahan kekeringan (OsER1)
(Sugianto, 2017)
Farmasi dan Kedokteran
Contoh :
Farmasi dan Kedokteran
1. Terapi gen, dapat dilakukan melalui : 2. Produksi Insulin dengan bakteri E. coli
a. Penggantian gen yang termutasi dengan
salinan gen sehat.
b. Inaktivasi (knocking off) gen yang
termutasi.
c. Pengenalan gen baru untuk membantu
mengatasi penyakit tertentu (Widyastuti,
2017).
Contoh terapi gen: Pengobatan penyakit
Thallasemia, Pengobatan penyakit Hemofilia,
dan Pengobatan Penyakit ADA (Adenosina
Deaminase).
32
Dampak GMO
 •Mengembangkan tanaman-tanaman pertanian yang
bersifat unggul
•Meningkatnya tingkat kesehatan manusia dengan
diproduksinya berbagai hormon manusia seperti insulin dan

Dampak hormon pertumbuhan

•Tersedianya bahan makanan yang lebih melimpah

Positif •Meningkatkan efisiensi dan produktivitas

•Proses industri yang lebih murah
•Berkurangnya polusi
•Meningkatkan Nilai ekonomi produk,
•Untuk terapi penyakit-penyakit tertentu melalui terapi gen
 • Munculnya bahan kimia baru yang berpotensi menimbulkan pengaruh
toksisitas pada tanaman yang berada di lingkungan pertanian
• Menimbulkan gangguan keseimbangan ekosistem akibat musnahnya
plasma nutfah organisme di lingkungan perkebunan

Dampak
• Menimbulkan penyakit baru atau pun menjadi faktor pemicu bagi penyakit
lain.
• Berkurangnya kualitas dari makanan tersebut

negatif • Tahan terhadap antibiotik

• Adanya kemungkinan bahwa makanan produk-produk rekayasa genetika
tersebut mengandung racun yang berasal dari bahan-bahan yang
digunakan untuk melakukan rekayasa genetika
• Adanya kemungkinan dapat menimbulkan alergi bagi yang mengkonsumsi
• Bertentangan dengan agama/ etnis/ budaya tertentu
• Merusak lingkungan
Study case
 Comparative performance of modified full-length and truncated Bacillus thuringiensis-
cry1Ac genes in transgenic tomato
Latar belakang:
Gen Bt-cry1Ac telah dianggap efektif melawan Helicoverpa armigera yang merupakan hama serangga lepidoptera yang terkenal. Laporan tentang ekspresi
gen cry1Ac full-length dan terpotong pada tanaman memberikan resistensi yang efektif terhadap Helicoverpa sp. namun, kinerja mereka masih ambigu.
Terlebih lagi, bahwa pemotongan gen pada ujung 3 ′ disarankan untuk menghasilkan insektisida aktif untuk menghasilkan produksi racun sementara secara
transgenik pada tanaman kapas yang dikomersialkan didasarkan pada gen cry 1Ac full length (panjang penuh). Oleh karena itu, kami melakukan studi
komparatif tentang kemanjuran dari dua versi gen cry1Ac (full-length: 3,510 bp dan dipotong: 1,845 bp) di T0 dan T1 tanaman tomat transgenik dan
dianalisis tingkat perlindungan terhadap H. armigera dan juga membandingkan hasil dengan temuan kami sebelumnya terkait dengan tomat transgenik
sukses Ab25E, mengekspresikan gen cry1Ab. Integrasi gen cry1Ac (s) di T0 tanaman transgenik dan warisan di T1 progeni adalah diamati dengan PCR, RT-
PCR dan Hibridisasi Southernbolt analisis sementara, integritas toksin, ekspresi dan toksisitas dipantau oleh Western immunoassay, DAS-ELISA dan
bioassay serangga.
Tujuan Penelitian:
Memperkenalkan strategi yang lebih untuk mengatasi masalah serangga hama dan manajemen resistensi, untuk produktivitas pertanian berkelanjutan
dengan cara menciptakan biopestisida.

39
Comparative performance of modified full-length and truncated Bacillus thuringiensis-
cry1Ac genes in transgenic tomato
HASIL:
Frekuensi transformasi rata-rata dan kandungan protein Bt-Cry 16,93 ± 2,10 dan 0,0020-0,0128% dari
total larut protein (TSP) diperoleh dengan vektor pRD400 (Trcry1Ac) sementara, nilai yang jauh lebih
rendah dari 9,30 ± 2,041 dan 0,0001 - 0,0026% dari TSP diamati dengan vektor pNBRI-1 (Flcry1Ac),
masing-masing. Tanaman transgenik Trcry1Ac T0 yang menjanjikan dan T1 mereka progeni memberikan
perlindungan penuh dari H. armigera. Meskipun gen Flcry1Ac menunjukkan frekuensi transformasi yang
lebih rendah dan ekspresi yang lebih rendah, itu menunjukkan toksisitas yang lebih tinggi untuk H.
armigera bila dibandingkan dengan gen Trcry1Ac terpotong.

The Power of PowerPoint | thepopp.com 40

Diagram skematik daerah T-DNA dari vektor ekspresi yang digunakan untuk transformasi tomat pRD400. B
pNBRI–1. RB and LB kanan dan kiri batasan sekuens; nptII koding wilayah gen neomisin fosfotransferase;
DECaMV35S-CaMV35S promotor ganda; cry1Ac-sequence pengkodean untuk gen cry1Ac; Pnos-promoter
sekuens dari nopaline synthase; Tnos-terminator sekuens dari sintesis nopaline. Garis tebal ( ---) menunjukkan
fragmen yang digunakan untuk probe DNA dan panah (   )menunjukkan situs primer oligo digunakan untuk
amplifikasi PCR dilambangkan sebagai A1 B1, A2 B2 dan A3 B3.
a.) Secara keseluruhan rata-rata hari onset berbunga, di 30 tanaman tomat transgenik dari masing-masing kelompok.
b.)Jumlah buah rata-rata per tanaman di 30 tanaman tomat transgenik dari masing-masing kelompok.
c.)Berat kering rata-rata 30 tanaman tomat transgenik dari setiap kelompok tanaman.
d.)Jumlah rata-rata biji (per gram buah) dalam delapan buah tanaman transgenik individu, di 30 tanaman dari setiap
kelompok. Nilai dalam kurung menunjukkan probabilitas yang terkait dengan t-test berpasangan siswa dengan distribusi dua
buah. Ketika P <0,05 perbedaan nilai parametrik individu dengan nilai kontrol signifikan.

42
Skrining tanaman tomat transgenik T0 dan T1 Trcry1Ac.A – C.)
PCR amplifikasi gen cry1Ac 995 bp.D – F.) 678 bp gen nptII
menggunakan primer spesifik gen dalam tiga puluh T0
transgenik.G-H.) Analisis RT-PCR dari sepuluh tanaman tomat
T0 transgenik yang dipilih secara acak dari cry1Ac yang
menunjukkan gen 995 bp cry1Ac dan 678 bp nptII transcript
gen. M - 100 bp DNA ladder (NEB, USA). -C - tanaman kontrol
non-transgenik, + C - plasmid DNA kontrol positif.I.) Analisis
waktu nyata untuk tingkat transkripsi Bt-cry1Ac di enam T0
tanaman tomat transgenik. TC - Tanaman transgenik dengan
ekspresi rendah Bt-toksin digunakan sebagai kontrol.J-O.) PCR
amplifikasi dari 995 bp gen cry1Ac dan 678 bp gen nptII
menggunakan primer spesifik gen inT1 progeni dari orangtua T0
yang menjanjikan. M −100 bp DNA ladder (NEB, USA). –C:
tanaman kontrol non transgenik, + C: kontrol positif DNA
plasmid. 43
Analisis dari Southern blot dan Western immunoblot dari transgenik T0 Trcry1Ac.A.) Analisis hibridisasi blot Selatan dari delapan T0 tanaman tomat
transgenik dari cry1Ac yang diperiksa dengan 1.841 bp fragmen BamHI-EcoRI berantai dari gen cry1Ac. + C fragmen gen 1,845 bp cry1Ac; −C Tanaman
kontrol tidak berubah.B.) Analisis imunoblot Barat dari sepuluh T0 tanaman transgenik, dengan ekstrak protein kasar; jalur 1: protein Cry1Ac yang
dimurnikan; jalur 12: protein tanaman pengendali yang tidak ditransformasi; jalur 2–11: sampel protein dari sepuluh tanaman transgenik. Sampel
transgenik memberikan band ~ 65 kDa, mirip dengan kontrol positif. –C: Pabrik kontrol yang tidak berubah.

44
Ekspresi gen Trcry1Ac pada tanaman transgenik. A.) Tiga Puluh T0. B.) Transgenik T1 terpilih. Bilah vertikal berarsir abu-
abu melambangkan kandungan rata-rata protein Bt-Cry1Ac. Kotak (persegi hijau) mewakili rata-rata status kematian%
H. armigera, ketika dikenai daun T0 dan tanaman tomat transgenik T1 masing-masing. ‘N’ adalah jumlah populasi
transgenik T1 dari masing-masing orang tua.
45
Karakterisasi molekuler tanaman tomat transgenik T0 Flcry1Ac. Upper Panel
A – C.) PCR amplifikasi 768 bp gen Flcry1Ac menggunakan primer spesifik
dalam tiga puluh T0 transgenik. D-F.) Analisis RT-PCR tanaman tomat
transgenik T0 menunjukkan 768 bp amplikon gen cry1Ac. M: 100 bp DNA
ladder (NEB, USA). -C: tanaman kontrol non-transgenik, + C: kontrol positif
plasmid DNA. Panel Bawah G-I.) PCR amplifikasi gen nptII 678 bp
menggunakan primer spesifik dalam transgenik T0. J-L.) Analisis RT-PCR
tanaman tomat transgenik T0 menunjukkan 678 bp amplikon gen nptII. M:
100 bp DNA ladder (NEB, USA). -C: tanaman kontrol non-transgenik, + C:
kontrol positif plasmid DNA.
46
Ekspresi gen Flcry1Ac pada tanaman transgenik. A.)
Tiga puluh T0 transgenik. BC.) T1 progeni FLAc 7 dan
11. Batang vertikal berarsir abu-abu melambangkan
kandungan rata-rata protein dan kotak Bt-Cry1Ac
(persegi hijau) mewakili rata-rata status
kematian% H. armigera, ketika dikenai daun T0
tanaman transgenik.

47
Karakterisasi molekuler dari T0 dan T1 progeni tanaman tomat transgenik FlAc7 dan
FlAc11.A.) Analisis PCR komparatif real-time dari transkrip di T0 Flcry1Ac tanaman
transgenik menunjukkan perubahan kali lipat dalam ekspresi sehubungan dengan
FlAC 9 (tanaman transgenik mengekspresikan rendah diambil sebagai referensi).
Kontrol: kontrol non-transgenik.B-C.) RT-PCR dan cDNA amplifikasi gen nptII 678 bp
dan gen Flcry1Ac 768 bp dari progeni T1 menggunakan primer spesifik. M: 100 bp
DNA ladder (NEB, USA). -C: tanaman kontrol non transgenik, + C: gen DNA plasmid
Flcry1Ac sebagai kontrol positif. D.) Southern blot diperiksa dengan 3.510 bp sinar
radiolabelled BamHI gen FlCry1Ac.E.) Uji imunoblot Barat dilakukan dengan ekstrak
protein daun mentah, lane1 protein toksin Cry1Ac yang dimurnikan, jalur 12: kontrol
yang tidak ditransformasi, jalur 2–11: ekstrak protein daun dari progeni T0 FlAc7
dan FlAc11. Pita protein ~ 130 kDa dalam tanaman transgenik menunjukkan
hibridisasi dengan antibodi Cry1Ac, serupa dengan kontrol positif

48
Comparative performance of modified full-length and truncated Bacillus thuringiensis-
cry1Ac genes in transgenic tomato

KESIMPULAN:
Gen cry1Ac full-length dapat didesain ulang agar ekspresi dan kinerja yang dihasilkan lebih
tinggi dalam dikot atau hibrida gen dapat dirancang supaya memiliki campuran strong receptor
dan menghasilkan karakteristik ekspresi stabil yang dapat meningkatkan toksisitas terhadap
serangga.

The Power of PowerPoint | thepopp.com 49

 REFERENCE
Amin, L., A. A. Azlan, M. H. Gausmian, J. Ahmad., A. L. Samian, M. S. Haron, dan N. M.
Sidek. 2010. Ethical perception of modern biotechnology with special focus on genetically
modified food among Muslims in Malaysia. AsPac J. Mol. Biol. Biotechnol., 18 (3) : 359-367.
Artanti, G.D., Hardinsyah, D. K. S. Swastika, dan Retnaningsih. 2010. Analisis faktor-
faktor yang mempengaruhi penerimaan petani terhadap produk rekayasa genetika. Jurnal
Gizi dan Pangan, 5 (2): 113 –120.
Mahrus. 2014. Kontroversi Produk Rekayasa Genetika Yang Dikonsumsi Masyarakat.
Jurnal Biologi Tropis. Vol. 14 No. 2

Prianto dan Yudasasmita. 2017. Tanaman Genetically Modified Organism (GMO) dan
perspektif hukumnya di Indonesia. Al – Kauniyah : Journal of Biology. Vol 10 (2) : 133
– 142

The Power of PowerPoint | thepopp.com 50

Thank You
Any question?