ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

MEDIANTE LA TÉCNICA
C

WESTERN BLOT
Equipo #2
 ¿Qué es?
• Es una técnica analítica, utilizada para el estudio de proteínas.
Este método permite la detección de una sola proteína dentro de una
muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante
la utilización de un antigeno- anticuerpo que reconoce y se une a un
epítopo único de la proteína de interés.

• Con esta técnica se puede estimar el tamaño de una proteína,

confirmar la presencia de modificaciones post-traducción como la
fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los
niveles de proteína entre muestras.
•Implica la separación por electroforesis en geles de
poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e
irreversible a una membrana de las proteínas de una
mezcla compleja

•Los antígenos que se han transferido a la membrana

son reconocidos por anticuerpos monoclonales
policlonales específicos de ellos.
TRANSFERENCIA
C
Que puede hacer la transferencia
del western blot
• Soporte para inmunoensayos, tinciones y otros análisis en fase solida estas
proteínas unidas a membrana pueden mantener su antigenicidad.
• Esta se puede llevar a cabo por medio de dos firmas diferentes; una es
humeda: en cámaras de llenado de un tampon
Simiesca: aparatos que no tienen camaras de llenado y no necesitan
cantidad de tampon.
 Como se realiza ....
• Una vez que la electroforesis del gel ha terminando las proteinas de ésta se transfieren a una
membrana, permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar, para
una transferencia efectiva las proteínas deben tener un estrecho contacto entre el gel y la
membrana.
• Tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada.
Típicamente, el tampón de transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional) y metanos
(para membranas de nitrocelulosa).
Tipos de membrana
• La membrana de PVDF, ofrece una mayor
resistencai mecánica, resistencia la SDS y una
mayor unión que la nitrocelulosa.
• La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de
proporcionar un menor ruido de fondo y que no
requieren un pretratamiento con metanol.
• Recientemente se han desarrollado, con el
objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar
métodos de detección de fluorescencia,
membranas PVDF de baja autofluorescencia.
¿Por qué se tiene que realizar
este paso?
•Para inmovilizar las proteínas,
permitiendo así que la hibridación
de un anticuerpo las pueda
detectar.
Condiciones
• Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas.
• Quitar o evitar las burbujas de aire entre el gel y la membrana.
• No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia.
• Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína.
• La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia.
Tipos de revelados.
• Los revelados empleados comúnmente en Westernblot están asociados a enzimas,
que catalizan una reacción en la que se forma un precipitado coloreado, o en la que
se emite luz. Las dos enzimas más empleados para marcar los anticuerpos son la
peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina.

• Revelado Colorimétrico.
• Revelado Quimioluminiscente.
• Revelado Inmunofluorecencia.
 Revelado colorimétrico.
• La utilización de sustratos colorimétricos se basan en la formación de un producto
coloreado insoluble que precipita sobre la membrana en el lugar de acción del
enzima. Este tipo de reacciones es irreversible, ya que una vez formado el precipitado,
no puede reutilizarse la membrana.

• Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado

previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina).

• El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la

membrana. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la
muestra. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por
un densitómetro.
Ventajas y desventajas del revelado
colorimétrico:
• Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cámara oscura, las membranas se pueden
documentar fácilmente mediante fotografía.

• Desventajas: no es tan sensible como los otros dos métodos, el color se desvanece con
el tiempo.
Revelado quimioluminiscente.
• La reacción quimioluminiscente ocurre cuando la energía de una reacción química se
emite en forma de luz. El sustrato quimioluminicente más utilizado es el luminol.
• La reacción de oxidación de este sustrato catalizada por la que se emplea con la
peroxidasa de rábano (HRP) en presencia de peróxido de hidrógeno.
• Inmediatamente después de su oxidación, el luminol se encuentra en un estado excitado
del que pasa a la situación basal, reducida, más estable, emitiendo luz.
• La detección quimioluminiscente requiere la incubación de la membrana con un sustrato,
que emitirá luminiscencia al ser expuesto al reporte que trae unido el anticuerpo
secundario.
• La luz emitida es captada por una película fotográfica o, más recientemente, por cámaras
CCD, que toman una imagen digital del Western blot.
• Se analiza la imagen por densitometría para evaluar la cantidad relativa de mancha y
cuantifica el resultado en términos de densidad óptica.
• Actualmente hay programas que permiten realizar análisis más profundos si se aplican
ciertos estándares, como la obtención del peso molecular.
 Ventajas y desventajas del revelado
quimioluminiscente:
• Ventajas: muy sensible, la membrana puede tratarse para reutilizarse, se pueden
hacer múltiples exposiciones en películas de rayos X, fácil de documentar.
• Desventajas: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen
caros, semicuantitativa porque se basa en una reacción enzimática, la película tiene
un rango dinámico limitado, la intensidad de la señal puede variar con la incubación
o el tiempo de exposición, no son posibles detecciones multiplex (detección de mas
de una proteína, sólo un color de reacción).
Inmunofluorescencia
¿Que es la fluorescencia?
Es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta
a radiaciones de baja longitud de onda y alta energía, se produce
por la absorción de luz por parte de la molécula de flurocromo la
eleva a un estado de exitacion en el cual contiene mayor energía.

Inmunofluoresencia directa
La muestra clínica que presuntamente contiene antígenos del
microorganismo bajo estudio es puesta en contacto con un
anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho microorganismo
conjugado con fluoresceína. Si el antígeno esperado esta presente
se forma un complejo antígeno-anticuerpo. La reacción positiva
en forma de fluorescencia verde manzana puede verse con la
ayuda de un microscopio de fluorescencia.
• Inmunofluoresencia indirecta
• Es una técnica de doble capa donde se aplica el
anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de
tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-
inmunoglobulina conjugado con fluorocromo.
• El proceso consta de dos etapas:
• Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los
antígenos que constituyen el substrato conocido
específico sobre el se coloca específicos, si la reacción es
positiva se dará formación de complejo antígeno-
anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba
marcado.
• Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina
humana marcada, que reaccionará con el anticuerpo
del complejo producido en la primera etapa.
 Tipos de anticuerpos
Las clases de inmunoglobulinas que aparecen en la especie humana son: G, M, A, D y E.
La clasificación en un tipo u otro depende de la cadena pesada que posean.
• Inmunoglobulina G: es la que se encuentra en mayor proporción. Se encuentra en
gran proporción en la respuesta inmune secundaria. Se une rápidamente con
macrófagos y neutrófilos, provocando la destrucción del microorganismo. Es la
inmunoglobulina responsable de la inmunidad del feto y del recién nacido.
• Inmunoglobulina M: En los linfocitos B aparece unida a su membrana plasmática.
Actúa en la respuesta inmune primaria activando al sistema del complemento.
• Inmunoglobulina A: Se encuentra en las secreciones tanto serosas como mucosas, de
la saliva, moco, leche o lágrimas. Actúa como barrera protectora de la superficie
corporal y los conductos secretores. Se produce, junto con la inmunoglobulina G.
Genera inmunidad al recién nacido, al encontrarse en la leche.
• Inmunoglobulina D: Su estructura es semejante a la de la inmunoglobulina G, pero
se diferencia en la posición de los restos glucocídicos de las cadenas proteicas. Son
las primeras inmunoglobulinas sintetizadas por los linfocitos B. Su función puede estar
relacionada con la activación de estas células.
• Inmunoglobulina E: se encuentra en concentraciones mínimas (0.002%) en el suero y
secreciones que se liberan al exterior. Se une a receptores de mastocitos y basófilos
haciendo que estos segreguen histamina. Está íntimamente relacionada con los
procesos alérgicos.
Reacciones de los Anticuerpos

Anticuerpos policlonales son creados cuando el

cuerpo es presentado con un antígeno y
muchas células B son activadas para producir
anticuerpos.

Anticuerpos monoclonales son aquellos que se

derivan de un sólo tipo de célula B.
 WESTERN BLOT C

Aplicada a la vacuna antimeningocócica

 Aplicaciones en la medicina
• En el caso de las infecciones con el virus VIH es una de las
técnicas utilizadas para detectar la presencia de
anticuerpos circulantes contra las proteínas del virus que es
una indicación muy fuerte de que la persona se encuentra
infectada por este virus.
• Detección de enfermedades infecto-contagiosas
• Enfermedades inflamatorias
• Perfil de citoquinas en modelos experimentales
• Factores de crecimiento
• Proteínas de secreción
Bibliografia
• http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf