Microbiología General

Seminario Nro. 1
Esterilización y Bioseguridad
 Algunos conceptos básicos...
Esterilización: eliminación o muerte de todos los
microorganismos que contiene un objeto o sustancia.

Bactericida: Agentes que destruyen y matan a las bacterias

Bacteriostático: Agentes que inhiben el crecimiento de las

bacterias

Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en

superficies inanimadas tales como mesadas de trabajo.

 Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de

microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas
 Esterilización

Criterio de muerte para un microorganismo

Perdida irreversible de su capacidad de

reproducción
 Cinética de Muerte de un MO
La muerte de microorganismos como consecuencia de un
tratamiento a altas temperaturas sigue una cinética
exponencial.

Nº ufc

dN
= - K´N
dt

tiempo
Cinética de Muerte de un MO
 VALOR D : Tiempo de reducción decimal
Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes
caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número
de supervivientes se reduzca en una unidad).

El tiempo (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a
mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos
microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas.
VALOR D : Tiempo de reducción decimal
log nº m.o. viables Efecto de la Temperatura

100 50 ºC
¿ A que temperatura
es menor el valor de
10 D?
70 ºC 60 ºC
1

tiempo
 D es un parámetro de la sensibilidad de un Microorganismo
determinado al efecto de la temperatura
log nº MO viables

100 A
¿Cuál es el MO
más sensible al
10 tratamiento?
B

1 C

tiempo
 VALOR Z
Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma
logarítmica. De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para
lograr que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el
valor z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados)
necesario para que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial.

donde ∆T es el incremento
de temperatura, y DT1 y
DT2 los valores de D a las
dos temperaturas
estudiadas.
Efecto de la Temperatura sobre características de los alimentos
Efecto de la carga inicial (No)

log Nº sobrevivientes 8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 20 40 60 80
Tiempo (min)
 Esterilización en Microbiología de Alimentos

Desde el punto de vista de la salud alimentaria, se suele requerir un

tratamiento 12D de los productos susceptibles de ser portadores de
gérmenes patógenos (o que puedan dar lugar a intoxicaciones). Este
tratamiento reduce en 12 órdenes de magnitud el número de
supervivientes o bien, visto de otra forma, reduce en un factor de 10-12
la probabilidad de supervivencia de un microorganismo dado. Si
consideramos que un solo microorganismo contaminaba una unidad
(una lata, por ejemplo) del alimento inicial, después de un tratamiento
12D la probabilidad de encontrar una lata contaminada se reduce hasta
10-12.
Clostridium botulinum
D121 = 0.20 min
No = 3.5 x 10 5 ufc/lata 3.5 x 10 15 ufc/ lata
Tiempo de tratamiento a 121°C = 2 min
NF = ¿?
 Log 10
Valor D=1 minuto
Recuento de viables
6
5 105
4

3
B
2
A
1
0 0

Probabilidad de
1 2 3 4 5 6 7 1

sobrevivientes
Tiempo
2
(min)
3
4

5
6
Log 10
 Log 10

Recuento de viables
12
10
8

6
4 MO A
2 D=1 min a 121 ºC
0 0

Probabilidad de
1 2 3 4 5 6 7 2

sobrevivientes
MO B
Tiempo 4
D=0.5 min a (min)
121 ºC 6
8

10

12
Log 10
 Ejercicios
– Si se ha determinado que para esporas de Clostridium botulinum
suspendidas en buffer fosfato el D121 = 0.204 min, ¿Cuánto
tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C.
botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 121°C?

– Para el mismo sistema se sabe que el valor Z= 10ºC. ¿Cuánto

tiempo llevaría reducir una población de 1012 esporas de C.
botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 111°C?

– La leche cruda a la entrada de la planta de procesamiento tiene

una carga bacteriana de 4x105ufc/ml. La leche se va a procesar a
79ºC por 21 segundos. Si el valor D promedio para la población
bacteriana a 65ºC es de 21 segundos y el valor Z es de 7ºC,
cuántos microorganismos quedarán luego del tratamiento a
79ºC?¿Cuánto tiempo se requeriría para lograr el mismo grado de
letalidad a 65ºC?¿Cuánto tiempo llevaría reducir la concentración
a 1ufc/100ml con un tratamiento a 65ºC?
 Agentes Físicos

•CALOR

•RADIACIONES

•FILTRACIÓN
 Calor

• Calor húmedo

Ambos pueden ser

utilizados en procesos de
esterilización

• Calor seco
 Calor húmedo
PROCESOS

• Esterilización:
 Vapor saturado a presiones mayores que la atmosférica
 Tindalización (fraccionada por vapor)
• Pasteurización
• UHT

MECANISMOS DE ACCIÓN

• Desnaturalización de proteínas
• Destrucción de ácidos nucleicos
 Pasteurización

•LHT (low temperature holding)

30 minutos a 62.8ºC

•HTST (high temperature short time)

15 segundos a 71.6ºC Louis Pasteur

•Solo destruye patógenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium

tuberculosis, etc.) y reduce flora de deterioro.

NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIÓN

•Usos: leche, lácteos, jugos de fruta

 UHT (Ultra high temperature)

• 140ºC-150ºC durante pocos segundos

• Proceso continuo

• Necesita envasado aséptico

• Si es un proceso de esterilización
 Tindalización

•100 ºC 30 min, 3 días sucesivos

•Proceso discontinuo con períodos de incubación intercalados

•Usos: esterilización de productos de baja resistencia

térmica, cuando no existe otra opción

John Tyndall
Vapor saturado a presiones mayores
que la atmosférica

• Condiciones: Vapor saturado a temperaturas mayores de

100ºC
(PRECAUCIÓN: eliminación total del aire)

• Equipo: Autoclave

• Alcance: Se puede conseguir esterilización

• Usos: Esterilización de materiales y productos termoestables

( salvo productos oleosos y polvos). Descontaminación de
desechos biológicos.
Autoclave
 Autoclave

Condiciones :
• 121ºC durante 15 minutos, con cargas iniciales bajas
• 121ºC durante 30 minutos, con cargas iniciales altas

Indicadores:
• Físicos: Temperatura y/o presión
• Químicos
• Indicador biológico: Geobacillus stearotermophilus
(D 121ºC=1.5 minutos)
Tamaño del inóculo: 104 esporas
 Perfil de temperatura de un proceso
de esterilización por calor húmedo

120
Temperatura ºC

110
1 2 3
100

Tiempo (min.)
15

Etapa de calentamiento Etapa de Etapa de enfriamiento

mantenimiento
 Calor Seco

•Mecanismo de acción: Procesos de oxidación

•Controles de proceso de esterilización

Indicadores físicos y químicos

Indicador biológico esporas de Bacillus subtilis var. niger

(D 160ºC = 0.3 a 1.8 min, Z=20ºC, tamaño del inóculo: 105
esporas)
 Calor Seco
Aire caliente:

Equipo:Hornos eléctricos
Alcance: Se consigue esterilización (170ºC, 60 minutos o 160ºC, 120
minutos)
Usos:

a) Esterilización de:

• Materiales resistentes al calor

• Sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos, siliconas,
vaselina líquida)
• Polvos

b) Despirogenizacion (250ºC 45 minutos o 180ºC 4hs, o 650 1 min)

• Incineración:
Destrucción de material
contaminado

Flameado :
Desinfección
 Resistencia a calor

RESISTENCIA
 Priones +
 Endosporas bacterianas
 Mycobacteria
 Virus sin envoltura lipídica
 Hongos
_
 Bacterias
 Virus con envoltura lipídica
 Esterilización por filtración
La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a
través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La
esterilización por filtración se emplea para materiales sensibles al calor, tales
como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos y otros
medicamentos, etc.
Filtros de profundidad:
Estos filtros están elaborados por un material
fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto
al azar, de manera que dentro de la estructura del
filtro se crean vías tortuosas donde pueden quedar
retenidos la mayoría de los contaminantes
presentes.

Filtros de superficie:
Son filtros elaborados generalmente de acetato de
celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de
tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como
ventaja que, al conocer exactamente el tamaño de
poro que presentan, se pueden seleccionar filtros
capaces de retener la totalidad de los
microorganismos presentes en una solución. Sin
embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de
filtración a través de ellos es lenta.
La mayor parte de los filtros de membrana se
pueden esterilizar en autoclave y luego se
manipulan asépticamente al ensamblar el equipo.
 FILTRACIÓN DE AIRE

•Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air)

•Remoción de hasta el 99.97% de partículas mayores de 0.3 micrones de
diámetro
•Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminar

CONTROL
•Retención Mínima de un 99.97% de partículas generadas mediante ensayo
DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un diámetro de 0.3 micrones.

SE USAN PARA Lograr ambientes con número de partículas

controlado: FLUJOS LAMINARES
AREAS DE TRABAJO
Cabinas de Flujo Laminar
Vertical
Salida de aire

Protege la
muestra, el
operador y el
Entrada medio ambiente
de aire
 Esterilización por radiaciones

Baja energía

Actividad
antimicrobiana
Alta energía

Dos tipos: Radiaciones ionizantes

Radiaciones no ionizantes
 Radiaciones Ionizantes

Características:
• Alta energía, baja longitud de
onda
• Gran poder de penetración
• Ionizan átomos y moléculas
• No requieren altas temperaturas
Tipos:
• Rayos gamma (60Co o 137Cs)
• Rayos catódicos (electrones
acelerados)
• Partículas beta
Mecanismos de acción:
• Formación de radicales libres
• Daño al ADN, ARN

Resistencia:
Priones
Deinococcus radiodurans
Enterococcus faecium
D (kGy) m.o.
Esporas bacterianas 3 Bacillus pumilus
1.2 Staphylococcus spp.
Virus
Hongos
Bacterias (en gral)
Desventajas:
Equipo especial, personal entrenado
No todos los materiales resisten el tratamiento
Reacciones no deseadas en alimentos
 Radiaciones no Ionizantes
Características:
• Baja energía, sin poder ionizante
• Sin poder penetrante
• Máxima eficiencia biocida a 260nm

Mecanismos de acción:
• Sitio blanco ADN NO SE UTILIZAN
PARA
• Formación de dímeros de timina ESTERILIZAR
SINO PARA:
Usos:
• Desinfección de superficies
• Desinfección de aire y agua
 ESTERILIZACIÓN
Luz ultravioleta POR RADIACION UV
La radiación ultravioleta producida artificialmente en el espectro de 250 nm ha
sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por más de 30 años.
La acción de los rayos ultravioleta se debe a la producción de ozono que logra la
asepsia, ya que este gas conserva su acción inhibidora hasta una dilución de 1 x
40.000. Los aminoácidos aromáticos de las proteínas y las bases puricas y
primidinicas, en particular la timina del DNA, son los principales compuesto
blancos afectados por la acción bactericida de la acción ultravioleta. Evitando la
replicación de las tiras del DNA o causando recombinaciones que terminan en
mutaciones mortales.

Dímeros de timina
 Procesos de esterilización
Agente Condiciones Usos

Calor húmedo 121ºC 15 min. Material termoestable

(o equivalente) Penetrable por vapor

Calor seco 160ºC 2 horas Material termoestable

180ºC 1 hora No penetrable por vapor

Radiaciones 25KGy Material termosensible

ionizantes 45KGy Resistente al tratamiento

Filtración 0.22 micras de poro Material filtrable

 Control de Esterilización

• Controles del proceso

Indicadores: Físicos
Químicos
Biológicos

• Post-proceso: TEST DE ESTERILIDAD !!!

 Controles del proceso

Indicador físico Ej: Temperatura, presión

Indicador químico Cambio de color

Indicador biológico Microorganismo resistente

Agentes químicos de esterilización y
control del crecimiento
Antisépticos
Alcoholes
Iodo
Órgano-Mercuriales
Colorantes

Desinfectantes y/o Esterilizantes

Cloro y Compuestos clorados
Aldehídos
Oxido de Etileno
Compuestos Fenólicos
Alcoholes

•Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan

proteínas. Desorganizan la estructura fosfolipídica de la membrana.
•No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta.
•Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de
cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%.
•Los más utilizados son el etanol e isopropílico.

Iodo

•Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos

nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S,
pudiendo atacar también grupos amino, indoles, etc.
•Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y
yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante.
•Es efectivo contra esporas en una concentración de 1600 ppm de
iodo libre
Peróxido de Hidrógeno

•Es un antiséptico débil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres.

•Actualmente, el peróxido de hidrógeno gaseoso se está utilizando como
desinfectante de superficies o decontaminante de gabinetes biológicos debido a
que no posee las propiedades tóxicas y cancerigenas del óxido de etileno y
formaldehído.

Órgano-Mercuriales
•Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las proteínas,
inactivando enzimas.
•Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran el metafen y el mertiolate.
Colorantes

Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde

brillante) bloquean la conversión del ácido UDP-acetilmurámico en UDP-
acetilmuramil-péptido.

R = HSO4- Verde Brillante

R = Cl- Verde de Malaquita Violeta de Genciana
Cloro y sus derivados
El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre
proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y
atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.
El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua
lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y
además es efectivo en un amplio rango de temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso
(HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua.

El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l

de Cloro activo) y Generalmente, se utilizan soluciones con una concentración
del 0.1-0.5% de Cloro activo.
Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica
Aldehídos

•Son agentes alquilantes que actúan sobre proteínas, lo que provoca

modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática.
•Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas.
•El glutaraldehído es el único esterilizante efectivo en frío.
•El formaldehído como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes,
etc.
•El formaldehído gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehído
tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes
refrigerados.

Glutaraldehido Paraformaldehido Formaldehido

Oxido de Etileno
•Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles
como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
•Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria
farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el
descartable y plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc.
Es muy peligroso
Compuestos Fenólicos
•Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática
porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos.
•El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable,
por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies.
•Los derivados del fenol más utilizados son el hexaclorofeno (compuesto
difenílico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas
concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos
contra esporas.

Coeficiente del fenol

BIOSEGURIDAD
 Bioseguridad
•Contención primaria: protección del personal y del medio ambiente
inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos.

•Contención secundaria: Protección del medio ambiente externo al

laboratorio de la exposición a materiales infecciosos

•Equipos de Seguridad (Barreras Primarias). Los equipos de

seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes
cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar
las exposiciones a materiales biológicos peligrosos.

•Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias)

•Riesgo Biológico: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de

infección, alergia, o toxicidad por una exposición no controlada a agentes
biológicos.
 Bioseguridad

Niveles de Bioseguridad
 Bioseguridad

Agentes de Riesgo

Se entiende por agente de riesgo biológico cualquier

microorganismo -incluyendo de los genéticamente
modificados- cultivo celular, animal o planta o producto
de estos, capaz de producir cualquier tipo de infección,
alergia o toxicidad en humanos, animales u otros seres
vivos.
 Bioseguridad

Agentes de Riesgo - Grupo I

Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes

bien identificados que se sabe que no producen
enfermedad en humanos sanos y existe un potencial
mínimo de peligro para el personal del laboratorio y el
ambiente.

Bacillus subtillis
Naegleria gruberi
virus de la hepatitis canina infecciosa
 Bioseguridad

Agentes de Riesgo - Grupo II

Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes
asociados con enfermedades en humanos, especialmente por
ingestión o exposición percutánea o mucosa.
Patógenos que pueden producir enfermedad en humanos
animales pero es poco probable que sea un problema para los
trabajadores del laboratorio, la comunidad, los animales o el
ambiente. La exposición en el laboratorio puede producir una
enfermedad seria pero existe tratamiento efectivo y las
medidas preventivas están disponibles, el riesgo de dispersión
de la enfermedad es limitado.

Salmonella spp.
Virus de la Hepatitis B
Toxoplasma spp.
Bacillus anthracis
Bordetella pertussis
 Bioseguridad

Agentes de Riesgo - Grupo III

Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con

animales infectados con agentes exóticos que tienen riesgo de
transmisión por aerosoles y pueden causar una enfermedad
seria o potencialmente letal.
Patógenos que usualmente causan serias enfermedades en
animales y humanos pero que comúnmente no se propagan de
un individuo infectado a otro. Las medidas preventivas y de
tratamiento efectivo están disponibles.

Brucella bortus
Coxiella burnetii
Mycobacterium
 Bioseguridad

Agentes de Riesgo - Grupo IV

Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes

peligrosos que tienen alto riesgo de amenazar la vida,
transmitirse por vía aérea o que se desconoce su riesgo de
transmisión.
Patógenos que usualmente causas serian enfermedades en los
animales o los humanos y que pueden transmitirse de un
individuo de forma directa o indirecta. Usualmente no están
disponibles ni medidas preventivas ni tratamiento efectivo.

Virus de Marburg
Ebola
Virus Junín
 Bioseguridad

Gabinetes de seguridad biológica

Clase I (Campana)

C. Filtro de
B. Ventana Escape HEPA

A. Apertura frontal D. Pleno de Escape

 Bioseguridad
Gabinetes de seguridad biológica
Clase II (Flujo Laminar)
A. Apertura Frontal; B. Ventana;
C. Filtro de Escape HEPA; E. Pleno de Escape de
Presión Negativa; F. Ventilador; G. Filtro HEPA
adicional para enviar aire.

A. Apertura Frontal;
B. Ventana;
C. Filtro de escape HEPA;
D. Pleno posterior;
E. Filtro HEPA de Suministro;
F. Ventilador
 Bioseguridad

Gabinetes de seguridad biológica

Clase III (Flujo Laminar)

A. Inserciones para guantes con aros circulares para instalarles guantes

del largo del brazo al gabinete;B. Ventana, C. Filtro de Escape HEPA; D.
Filtro HEPA de Suministro; E. Caja para Autoclave de Doble Extremo.
 Bioseguridad

Transporte de material riesgoso