CURSO TALLER

Pucara - Cajamarca
07- 8 de Noviembre 2017

Diagnostico de
Peste
Blgo. Ever Francisco CORDOVA DIAZ
Laboratorio Referencia Nacional de Zoonosis Bacteriana
Laboratorio de Referencia de Peste-RINS/RAIS/OPS-OMS
Instituto Nacional de Salud
Av. Defensores del Morro 2268-Chorillos-Lima, Perú.
511-748 0000-Anexo 1537, 1429
ecordova@ins.gob.pe;
evercordov@hotmail.com
 Red de Laboratorios de Salud Publica de
Peste- Perú
Cajamarca-Jaén Amazonas-Bagua
2009 2000
Tumbes Loreto
09/02/99 Amazonas- Chachapoyas 18/12/94
2001
Laboratorios de Salud Cajamarca
Publica de Peste: 13/11/96
Loreto- Yurimaguas
Piura
17/06/94 Loreto- DATEM

 Laboratorio de Referencia Lambayeque

San Martín
25/07/94
Regional de Cajamarca (LR 27/10/95 Huánuco

Jaén), Piura, Lambayeque y La Libertad

Pasco Ucayali
28/02/98 Cusco
La Libertad. 2001
16/02/97
Ancash Madre de Dios
2000 Región Lima
2000
 Laboratorio Referencia LRN -INS
Callao

Nacional del Instituto Lima (LR Sur, Este, Ciudad) Abancay

26/05/99
Junín
Nacional de Salud-Lima 04/09/98
Huancavelica
(LRNZB) 2000
Puno
23/09/96
Ica

1 Lab. Referencia Nacional (LRN) Ayacucho

23/07/94
Arequipa
23 Lab. Referencia Regional (LRR) 06/11/96
Tacna
07 Lab. Referenciales (LR) Moquegua 20/12/96
 VIGILANCIA DE LA PESTE HUMANA

Peste : casos sospechosos

Tratamiento del sospechoso Tratamiento enfermo

Profilaxis contactos Alerta Profilaxis contactos
Désinsectacion vivienda sosopechoso Desinsectacion localidad
I.E.C. vivienda CS I.E.C. comunidad
Vigilancia
Vigilancia LRR

Nuevo Prueba Rapida

sospechoso

Control Control
Peste

- + ++ +++
Négativo Positivo
(1 linea) (2 lineas)

Declaración Alerta
Envìo de muestras Declaraciòn
Ficha
DISA
déclaration
INS
Laboratorio
LRNZB MINSA
 DIAGNOSTICO DE PESTE HUMANA
 Muestras biologicas para diagnostico de peste
1- Fase Aguda:
Pruebas microbiológicas y moleculares
• Pestes bubónica : aspirado de bubón
• Peste neumónica : esputo
• Peste septicémica : sangre
• muerte : hígado, bazo, pulmón, medula ósea
y dedo (2da ó 3era falange)
Pruebas inmunológicas
• muestra de suero
* Independientemente del tipo de peste, se debe obtener
adicionalmente muestras de sangre c/EDTA.
2- Fase Convaleciente:
muestras de suero pareado (seroconversión)
 DIAGNOSTICO DE PESTE ANIMAL
 Muestras biologicas para diagnostico de peste
1. Roedores y otros pequeños mamíferos silvestres
Sangre: con EDTA y suero
Órganos: ganglios, bazo e hígado.

2. Animales domésticos
Canes y otros: sangre con EDTA y suero

3. Vectores
Pulgas : En alcohol de 70°
 DIAGNOSTICO DE PESTE EN HUMANOS
 Pruebas para diagnóstico de peste
1. Pruebas Microbiológicas y biológicas:
• Cultivo en Agar Sangre, CIN, BHI, medio Hemina.
• Virulencia (Inoculación en ratones y biología molecular)
• Susceptibilidad antibiótica

2. Pruebas Microscopia :
• Gram, Wayson (bipolar)

3. Pruebas inmunológicas :
• ELISA IgG
• Prueba rápida inmunocromatografica Ag F1

4. Pruebas moleculares :
• PCR Convencional.
• PCR tiempo Real
• PFGE, secuenciamiento-WGS.
 INVESTIGACIÓN DE CAMPO
Captura e identificación de roedores: con
trampas Tomahawk y Sherman.

Colecta de sangre de animales domésticos:

perros, gatos, cuyes .

Colecta e identificación de vectores: colecta

de pulgas, garrapatas y ácaros de humanos,

roedores y animales domésticos.

Evaluación de eficacia de control de pulgas:

carbamatos, piretroides y otros.

control de roedores: Bromadiolone + fipronil

MUESTRAS
Criterios para el Diagnóstico Laboratorial de
Peste

 Sospechoso
 Presuntivo
 Confirmatorio
Criterios de Diagnóstico Laboratorial para la
Peste

Sospechoso
Síntomas clínicos compatibles con peste (fiebre,
linfadenopatía, síndrome de sepsis o neumonitis aguda) en
una persona que reside en un área endémica de peste o
que recientemente ha viajado a una.
 Criterios de Diagnóstico Laboratorial para la
Peste

Presuntivo
 Microscopía: muestra de bubón, sangre o esputo que contiene
cocobacilos Gramnegativos, bipolares después de tinción Wayson o
Giemsa;
 Antígeno F1 detectado en aspirado de bubón, sangre o esputo;
 Una serología anti-F1 única, sin evidencia de infección o
inmunización previa con Y. pestis; y
 Detección de Y. pestis por PCR en aspirado de bubón, sangre o
esputo.
 Criterios de Diagnóstico Laboratorial
para la Peste
Confirmado
 Un aislamiento de una muestra clínica única identificada
como Y. pestis (morfología de colonia y 2 de las 4 siguientes
pruebas positivas: lisis por bacteriófago de cultivos a 20-25 °C
y 37 °C; detección de antígeno; PCR; perfil bioquímico de Y.
pestis); o
 Una elevación en 4 títulos de Anticuerpos anti-F1 en muestras
de suero pareadas; o
 En áreas endémicas donde no pueda ser realizada otra
prueba confirmatoria, una prueba rápida positiva usando una
prueba inmunocromatografíca para detectar antígeno F1.
 Norma Técnica de Salud para la Prevención y Control de la Peste en el Perú

AISLAMIENTO DE Yersinia pestis

CULTIVO

CUADRO ANTECEDENTE PRUEBA PRUEBA

ELISA IgG PCR ELISA IgG
CLINICO EPIDEMIOLOG RAPIDA Coloracion RAPIDA
Gram Bioquimica Lisis por Pueba
PCR
por API20E Bacteriofago Rapida

CASO X X
SOSPECHOSO

CASO X X Por lo menos 2/ 1 (Zona Endemica)

PROBABLE

X Por lo menos 2 Una elevacion

en 4 Titulos en En areas
muestras endemicas
pareadas donde no pueda
CASO ser realizada
X X Por lo menos 2/ 1 (Zona Endemica) Aislamiento otra prueba
CONFIRMADO confirmatoria

Por lo menos 1 (Laboratorio)

Por lo menos 1
 Yersinia pestis
(Bacteriología y Genética)

• Enterobacteriaceae
• Cocobacilo, Gram-negativo,
1.5 µm x 0.75 µm
• Presenta una coloración bi-polar
con tinción Giemsa, Wright o
Wayson
– Apariencia de “imperdible”
 Yersinias Patogénica

 11 Especie Yersinia
 3 son patogénicas al ser humano:
- Y. pestis – agente etiológico de peste, parásito
obligado
- Y. pseudotuberculosis – principalmente causa
enfermedad entérica, primariamente
transmitida por agua
- Y. enterocolitica – causa evenamiento por
alimentos, transmitida por alimentos y agua
 Biovares de Yersinia pestis

Clasificados sobre la base de la conversión

de nitrato a nitrito y fermentación del glicerol

 orientalis- nitrito+, glicerol -

 antigua - nitrito+, glicerol+
 mediaevalis - nitrito-, glicerol+

No se conocen diferencias en su virulencia

o patogenicidad
 Características
Plásmidos de Y. pestis:
 110-KB (pTox, pFra, pMT1)
- Antígeno F1, toxina murina
 9.5-KB (pPla, pPst, pPCP1)
- pesticina, activador de plasminógeno (pla)
 70-kb (Respuesta baja en calcio, plásmidoLcr)
(pCad, pCD1); Plásmidos compartido de Yersiniae
- Antígeno V, Yops
PRUEBAS RAPIDA PARA EL
DIAGNOSTICO DE PESTE
 Evolución de Y. pestis y concentración de
antígeno F1
ATB
Fallecido sin tratamiento ATB

Y. Pestis
F1 antígeno Paciente recuperado

Anticuerpos

Fallecido sin tratamiento ATB

recuperado

Paciente recuperado

Fallecido sin
tratamiento ATB
Punto de
corte
F1
dipstick Paciente
recuperado
Inicio enfermedad Dias
D0 D6 D8

Antígeno F1 bubón / esputo Antígeno F1 sangre/ orina

Y. pestis bubon / esputo Anti-F1 anticuerpo IgG
 Antigeno F1 Y. pestis
• Glicoproteína Capsular - codificadas por el ADN
plasmídico (pFRA)
Y. pestis especifico
• Abundante (secretada at 37°C), resistente al calor
• Muestras de diferentes tipos (humanos, roedores)
•No influenciada por los contaminantes, el tratamiento
 2 TIPOS DE PRUEBAS RAPIDAS

• Detección de antígeno F1 de Yersinia pestis (F1

es un antígeno capsular )

• Detección de anticuerpos contra Yersinia pestis

(Immunoglobulin G)
 F1 RDT: tira para detección de antígeno F1

- Principio :
immunocromatografia con
partículas de oro coloidal
(Flujo vertical).
Visualizando :
la reacción antígeno-anticuerpo

- Muestras : bubón, esputo,

suero, orina, post-mortem,
bazo / hígado (ratas).
- Un solo pasos, 15 minutos
 Material toma de muestra y realización del F1RDT

Composición del kit para toma de muestra:

- Jeringa
- Aguja (18G)
- Hisopo algodón estéril
- Tubo Eppendorf con buffer fosfato salino
(PBS 1X)
- Tubo Cary Blair
- Alcohol pad
- Tubo para guardar todo

Materiales Adicional :
- Contenedor de esputo
- Laminas
- Estiquer y marcador

Composición del kit para diagnostico (F1RDT)

⁻ Tubo de plástico calibrado para ensayo con el Tira
⁻ Tira de nitrocelulosa
⁻ Buffer de dilución de la muestra
⁻ Gotero de plástico estéril
Material toma de muestra y realización del F1RDT

Peste Bubonica
1. Aspire todo el PBS 1X
2. Injectar en el bubon
3. Aspirar la pus
4. Homogenizar la muestras

Peste neumonica
1. Colectar esputo
2. Aspirar 0.5ml de esputo
3. Aspirar todo el PBS 1X Nom

4. Homogenizar la muestra
Material toma de muestra y realización del F1RDT

Peste Septicemica
1. Colectar la sangre

Ratas muertas
1. Aspirar todo el PBS 1X,
2. Injectar a nivel del bazo,
3. Reaspirar el liquido
4. Homogenizar la muestra
 Transporte de muestras

₋ Absorber unas gotas de la muestra con

la jeringas y embeber el hisopo estéril.
Insertar el hisopo en el medio de
transporte de Cary Blair (cultivo).

₋ Trasvasar el resto en el tubo eppendorf Cary Blair Tube eppendorf

y sellar con parafilm (PCR, RDT).

₋ El tubo con medio Cary Blair y el tubo

eppendorf poner dentro del frasco.

₋ Asimismo poner la ficha en una bolsa y

poner conjuntamente con las muestras
y transportar a temperatura ambiente.
 F1 RDT: Procedimiento del test

• Adicionar 2 gotas del homogenizado en buffer de

dilución incluido en el Kit de diagnostico.

• Homogenizar y agregar 4 gotas en el tubo

descartable de 13 x 100 incluido en el Kit de
diagnostico.

• Introducir la tira de nitrocelulosa incluido en el kit

de diagnostico.
• Después de 15 minutos hacer lectura.
 F1 RDT: lectura de resultados

C
T

N P P P P
0.5+ 1+ 2+ 3+
 Ventajas de la prueba RDT F1
• Bajo límite de detección (O.5 - 5 ng / ml)
• Rápido (15 minutos)
• Todas las muestras tipo (humanos, roedores)
• No influye contaminantes, el tratamiento
• Especificidad ~ 100%
• 100% de sensibilidad (falsos negativos)según la calidad / tipo
de muestras
• Bajo Costo 
Mapa de capacidades
de Diagnóstico por
pruebas rápidas-
Peste
Tinción Diferencial de Muestras para Detectar
Yersinia pestis

Tinción
Gram
Wayson/Giemsa

Interpretación
Bacilo gram negativo, con característica bipolar
puede sugerir la presencia de la bacteria de la peste
pero esta característica no es exclusiva para Y. pestis
 Tinción Diferencial de Muestras para
Detectar Yersinia pestis

Extendido de sangre, coloración Giemsa Impresión de tejido de hígado,

tinción de Wayson
 Cultivo Directo de Yersinia pestis:
Crecimiento en Placa de Agar

Condiciones para el crecimiento:

 Inocular dos placas, incubar
- 25-28oC, para un crecimiento más rápido de Y.
Pestis
- 37oC, para la expresión del antígeno F1
 Cultivo Directo de Yersinia pestis:
Crecimiento en Placa de Agar

Morfología colonial:

 A las 24 horas
- Pequeña, crecimiento casi invisible

 A las 48 horas
- Tamaño-- 1 a 2 mm colonias irregulares
- Color-- gris-blanco hasta amarillo pálido
- Textura-- densa, superficie gruesa e irregular
- “Bronce martillado”, “huevo frito”
Cultivo Directo de Yersinia pestis:
Crecimiento en Placa de Agar
 Cultivo Directo de Yersinia pestis: Crecimiento
del Cultivo en Caldo
Características de crecimiento en caldo:
 A las 24 horas
- Agrupaciones de crecimiento, generalmente cerca
del lado del tubo

 A las 48 horas
- Forma-- más grandes, agrupaciones más largas,
suspendidas de crecimiento – “estalactitas” o
“agrupaciones colgantes”
- Color-- gris-blanco
- Textura-- agrupaciones se tornan pesadas y
descienden al fondo del tubo. El medio está claro.
Cultivo Directo de Yersinia pestis:
Crecimiento del Cultivo en Caldo

Y.pestis Y. pseudotuberculosis
Prueba de Lisis del Bacteriófago para la
Identificación de Yersinia pestis

Prueba confirmatoria para recuperar

aislamientos

Resultados de la Prueba:
- La Y. pestis se lisa tanto a < 28oC como a 37oC
- La Y. pseudotuberculosis solamente se lisa a
37oC
 Prueba de Lisis del Bacteriófago
para la Identificación
de Yersinia pestis

22-28oC 37oC
Fila superior: Y. pestis A1122. Segunda fila: Y. pseudotuberculosis
 Inoculación en Ratón
para la Recuperación de Yersinia pestis
Reacción en el Ratón:
- Si el inóculo contiene Y. pestis viva y virulenta, los
ratones generalmente se enferman seriamente y
pueden morir de infección diseminada en 3-5 días
Posteriores exámenes:
- Recolectar el bazo/hígado de los ratones muertos
para cultivo y exámenes para la identificación del
aislamiento : DFA y IHC
Ensayo de Fluorescencia Directa (DFA)

Tejido de hígado de ratón infectado, 800X

Tinción Inmunohistoquímica (IHC)

Tejido de ratón infectado, 400X y 800X

Pruebas Serológicas para Detectar el Anticuerpo
del Antígeno F1 de Yersinia pestis
Inmunoensayo enzimático (ELISA)
- Suero humano y animales
- Prueba de inmunoglobulina
total (IG)
Antígeno- Anticuerpo
Técnicas Moleculares
para la Yersinia pestis
 Métodos Moleculares para
Analizar Y. pestis

Pruebas PCR
- PCR basado en gel- objetivo simple
- Multiplex
- Tiempo real
Perfil de plásmidos
Subtipificación molecular
- Electroforesis de gel pulsada por campo
- RFLP-IS 100 y RFLP IS1541
Métodos de Diagnóstico Basados en PCR
para Y. pestis
El PCR puede emplearse como una prueba
rápida y presuntiva

Pruebas de PCR
- Amplificación de objetivo direccionado
- No se requiere aislamiento
- Fácil de emplear: simple
- Poder de análisis: de buena a excelente
Objetivos de Gen para PCR para Y.
pestis

Algunos objetivos comunes de PCR

- Gen estructural caf1- F1
- Activador plasminogénico pla
- Pesticina pst
- 16S rADN
- Antígeno lcrV-V
- Genes de firma (YPO0392,
YPO1091,YPO20888)
 PCR Basado en Gel

PCR estándar

PCR amplifica y detecta

mediante gel electroforesis

PCR Multiplex

Estándar Multiplex
Detección por PCR del gene de
Y. pestis en Pulgas
 PCR Multiplex de Genes de Y.
pestis

16sRNA
pst
RepA

F1

Lane1: Marker; Lane 2: NM99-0030; Lane 3: Neg Cont; Lane 4: India 95-419;
Lane 5: India 95-420; Lane 6: India 95-421; Lane 7: Kolar-2: Lane 8: Marker:
Lane 9: NM99-0030; Lane 10: Neg Cont; Lane 11:195/P; Lane I2: India
17721; Lane 13: India 18626; Lane 14: India 18525.
TaqMan PCR
Perfiles de Plásmidos de Aislamientos de
Y. pestis
1. MW Marker
2. CO96-2780
110-KB 3. CO96-3188
70-KB
4. CO99-1133
5. NM99-0030
19-KB
6. CA97-1775
9.5-KB
7. A1122
8. EV-76
9. 195/P
10. Y. pstb 71-3425
11. Y. pstb #4 IIB
Tipificación molecular
Electroforesis en gel de campo
pulsado(PFGE)
Polimorfismo de la longitud del
fragmento de restricción (RFLP)

54
Casos relacionados Si

55
56
Perú

57
Dendograma de origen de Yersinia pestis de Perú por
lugar, especie y año de aislado
Criterios para evaluación de resultados de Laboratorio
 • Agradecimiento :
GERESA La Libertad y Lambayeque
DIRESA Cajamarca, Piura, Subregion Chota, Subregion Jaen
Ministerio de Salud (DGSP, DGE, DIGESA)

OPS-OMS
Insitutos Pasteur de Francia y Madagascar
Embajada de Francia
Concytec