SONDAS GÉNICAS COMERCIALES

Consiste en un fragmento de ADN complementario.

Es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN

o ADN y se unirá exclusivamente esa secuencia de la
SONDA que es copia.

Una sola sonda puede reconocer su homólogo único

entre millones. La sonda precisa en un mínimo de 20
nucleótidos.

La información genética de un organismo dado

A: Adenina está contenida en el ADN (ácido
T: Timina desoxirribonucleico) que se ubica en el núcleo de
G: Guanina cada célula de este organismo.
C: Citosina Por su parte, un nucleótido está formado por una
azúcar, un grupo fosfato y una de cuatro diferentes
bases nitrogenadas

TIPOS DE SONDAS
Sondas de DNA doble cadena
Pueden ser preparadas
utilizando “primer extension”
en templados de cadena
simple o por PCR con un
nucleótido marcado. Éste
último es el más usado porque
es más fácil de llevar a cabo y
las marcas pueden sintetizarse
con poca cantidad de
material.
Pueden ser preparadas
utilizando técnicas como
“nick translation, random
priming o PCR”, en las cuales
el nucleótido marcado es
incorporado. Estas sondas
pueden ser desnaturalizadas
antes de usar.
Cuando se usan para
detectar una cadena simple
como mRNA, estas son menos
sensibles
Sondas de DNA de cadena simple
 El PCR permite una gran flexibilidad en la elección de las secuencias
marcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido ampliamente
usadas.

Oligonucleótidos (entre 20 y 40 bases)

Son marcados incorporando oligonucleótidos modificados durante la
síntesis química o adicionando una cola marcada. Una de las desventajas
es que algunos oligonucleótidos marcados no se incorporan y por tanto la
sensibilidad disminuye.

Sondas de RNA de cadena sencilla

Pueden ser sintetizadas por el uso de una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA
polimerasa). La secuencia de la sonda es clonada en un vector que
flanqueará dos sitios distintos de iniciación.
 Las sondas pueden ser usadas para detectar
microorganismo directamente de una muestra clínica
(expectoración, orina, etcétera) o para confirmar la
identificación de un cultivo que por otros métodos tarda
varios días.

INDICACIONES
PARA EL USO DE Las sondas pueden ser usadas para hibridación in situ
SONDAS EN EL para evaluar la respuesta del huésped a un agente
LABORATORIO infeccioso en particular y también para determinar la
extensión de la infección mediante el estudio de
muestras de tejidos de varios órganos.

PREPARACIÓN DE LA
SONDA
Para sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversa
complementaria. Cuando las sondas son sintetizadas por transcripción,
involucra generar mRNA del gen endógeno.
 En general es preferible usar sondas específicas, ya que esto garantiza una
buena hibridación. Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse a
cabo, por ejemplo, si los genes todavía no están clonados de las especies
usadas para la hibridación o si la secuencia génica es muy similar entre
especies. Esto puede favorecer una hibridación entrecruzada.

EL DISEÑO DE LA SONDA
La hibridación entrecruzada utiliza sondas largas usadas bajo condiciones
selectivas especialmente después de la digestión con nucleasas, ya que una
sonda además de homóloga.

Para sondas es muy probable que algún gen distinto al de interés tenga una
secuencia idéntica. Alternativamente se puede hacer un screening y éste
puede ser realizado por búsqueda de secuencias en bases de datos.

Los mRNA poseen las secuencias poli(T) y poli(U), al transcribirse a cDNA se evita
que la sonda no incluya esta cola, porque secuencias largas, ricas en GC dan
una gran estabilidad a la sonda por los triples enlaces que se forman entre
estas bases.
ELECCIÓN DE LA SONDA

Las sondas específicas, pueden ser obtenidas por

síntesis de oligonucleótidos.

Se diseñan primers que serán usados para la

amplificación del fragmento deseado de DNA en el
PCR. Estos fragmentos pueden ser clonados y usados
para sintetizar cadenas dobles o sencillas de DNA o
RNA.

Alternativamente, para el caso de sondas de RNA,

pueden ser marcadas directamente sin clonación
incluyendo el primer marcado en el sitio de iniciación
de la RNA polimerasa.

Finalmente las sondas de DNA de doble cadena son

recomendadas para blancos de doble cadena y esto
puede ser suficientemente sensible para detectar
abundancia de cadena sencilla.
TAMAÑO DE LA SONDA

Las sondas largas pueden emitir una señal más fuerte debido a
que incorporan mayor número de nucleótidos marcados dentro de
ella. Sin embargo, las sondas que son tan largas dan señales
débiles, debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el
tejido. La mejor estrategia es usar una secuencia larga como
templado para la síntesis de la sonda pero asegurar que la sonda
generada es lo suficientemente pequeña para poder penetrar.

Se ha encontrado que las sondas de RNA que miden por

arriba de 1 kb proveen señales óptimas para la
hibridación in situ, en embriones fijados en para
formaldheído. La penetración está influenciada por el
tamaño de la sonda aunque también depende de la
naturaleza del tejido, de la forma de fijación y si el pre
tratamiento ha sido realizado para remover las
proteínas celulares.
 VENTAJAS DE LAS SONDAS
GENÉTICAS

Las ventajas de estas técnicas son que nos permiten investigar directamente al
microorganismo, sin necesidad de que se encuentre viable, ni de que esté en
cultivo puro.

Es posible utilizarlo en cualquier tiempo de muestra biológica y permite la identificación

de genes no expresados fenotípicamente. Son técnicas muy válidas, pues el ADN es muy
estable.

Se necesitan un número mínimo de copias del fragmento de ácido nucleico problema

que se quiere detectar, por eso en las muestras con escasos número de unidades
infecciosas se obtiene una baja sensibilidad.

Entre las principales ventajas de las sondas genéticas hay que destacar la sencillez de su
manipulación, que permite su adaptación a cualquier laboratorio. El principal
inconveniente es su coste. Es una tecnología muy utilizada en la actualidad en
laboratorios nivel II.
TECNOLOGÍAS GENÉTICAS Los científicos han desarrollado una
serie de técnicas bioquímicas y
genéticas mediante las cuales el ADN
puede ser separado y transferido de
una célula a otra. Algunos de esos
métodos de laboratorio ayudan a los
investigadores a estudiar las
propiedades de los genes en la
naturaleza

Para localizar un gen específico en un

cromosoma determinado se utiliza una
sonda de ADN, que es un gen clonado
o copiado al que se agrega un átomo
radiactivo. La sonda marcada
selecciona un segmento de ADN
complementario y se une a dicho
segmento; la sonda en cuestión se
puede detectar entonces mediante
sofisticadas técnicas de fotografía.
Southern blot
Esta técnica consiste en la en la
digestión del ADN mediante una
enzima de restricción y que a
continuación se somete a
electroforesis en un gel de agarosa.
Con ello se consigue separar los
fragmentos de restricción del ADN por
tamaños, siendo los fragmentos más
pequeños los que corren más rápido
en el gel.

Una copia “permanentemente” de estos

fragmentos se transfieren a un filtro de
nitrocelulosa que se une al ADN
monocatenario marcado
radiactivamente con 32P que hibridará
con el fragmento de ADN homólogo
del Southern blot, el cual a su vez
puede ser detectado mediante
autorradiografía.
 Secante de Southern

Para encontrar una mutación de un gen

determinado en una muestra de ADN
los científicos usan una sonda de ADN,
un tramo de ADN de un solo filamento
que coincide con parte del gen y se
une a un átomo radioactivo.

La sonda de un solo filamento busca y

se une al gen. Las señales radioactivas
de la sonda aparecen después en la
radiografía, mostrando dónde se
emparejan la sonda y el gen.
 Northern blot

Utiliza ARN mensajero como ácido

nucleico diana en el mismo
procedimiento. El ARNm es muy
inestable debido a las ribonucleasas
celulares intrínsecas. El uso de
inhibidores de ribonucleasas permite el
aislamiento del ARN mensajero que, si
se corre en un gel electroforético, se
puede transferir a un filtro.

En una alteración génica en la que no

se han identificado mutaciones en la
secuencia codificante, una alteración
en el tamaño del transcrito sugiera la
posibilidad de una mutación en una
región no codificante del gen, como la
zona de unión intrón-exón.
Hibridización con sondas
• Para estudios de ARN se requieren tejidos frescos
congelados rápidamente con nitrógeno líquido y para
estudios de ADN se pueden emplear tanto tejidos fijados
como congelados.

• Las sondas preparadas a partir del ADN o ARN específico

se pueden purificar por clonación o copia en un plásmido
del ADN o del ADNc (complementario) obtenido de
transcripciones de ARN. Utilizando el plásmido como
vector y bacterias como huéspedes, es posible producir
sondas genéticas en grandes cantidades.

• Los fragmentos de ADN o ARN (sondas) se someten a un

análisis de hibridización (o apareamiento con el
complementario que se encuentra en el material que se va
a probar); éste se puede hacer ya sea con ADN o ARN
tisular en solución, directamente en tejidos o células por
hibridización in situ, o se puede efectuar sobre ADN o
ARN transferidos en membranas de nitrocelulosa a partir
de una electroforesis en gel de agarosa.
Hibridización con sondas

La sensibilidad de las sondas depende de la cantidad

de material genético para la hibridización y su
especificidad depende de la calidad de la sonda.

Una de las principales limitaciones de esta técnica se

ve cuando existe una baja cantidad de ADN o ARN y
éste no se descubre. Muchas de estas pruebas tienen
una sensibilidad que les permite descubrir 105-106
moléculas o aun 103-104 moléculas; sin embargo,
esto puede ser insuficiente en muchas situaciones
clínicas.
Sondas génicas comerciales

La caracterización de genes que codifican caracteres

cuantitativos con importancia económica o de genes
causantes de enfermedades congénitas ha llegado a
tener mucha importancia.

Por su parte las enfermedades genéticas, aunque

menos diseminadas, producen un resultado similar,
afectando poblaciones humanas y animales.
Características:

Consiste en un fragmento de ADN complementario a la secuencia que se busca

y a la que se unirá de manera específica.

Estas etiquetas pueden ser moléculas marcadas con radiactividad o moléculas

portadoras de átomos fluorescentes que pueden ser detectadas por
autorradiografía la primera o con detectores de fluorescencia las segundas

El diagnóstico implica un entendimiento de la causa y, si es posible, un

conocimiento de los factores contribuyentes significativos que influyan en la
aparición de la enfermedad.