Anda di halaman 1dari 52

PENGECATAN 

HISTOPATOLOGI RUTIN / HE

Penguji : dr. Meira Dewi Kusuma A  Msi Med Sp.PA
                 dr. Devia Ekalistiana  Msi Med Sp.PA

Oleh : Franky Yusuf

PATOLOGI ANATOMIK
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2018
PENDAHULUAN

 Latar Belakang
 Histopatologi
Cabang ilmu biologi tentang kondisi dan fungsi
jaringan  suatu penyakit
Pemeriksaan histopatologi  memeriksa penyakit
berdasarkan reaksi perubahan jaringan dengan
membandingkan kondisi jaringan yang normal
dengan abnormal
Pemeriksaan histopatologi dapat dilakukan
dengan metode histoteknik
 Tujuan Teknik
 Metode pembuatan sediaan dari spesimen tertentu
 Melalui suatu rangkaian proses diperoleh suatu
preparat histopatologi yang siap untuk dianalisa
 Preparat histologi  mengetahui keadaan
patologis serta perubahan suatu sel atau
jaringan
 Rangkaian proses pembuatan sajian histopatologi
terdiri atas :
 Fiksasi
 Dehidrasi-Clearing-Impregnasi
 Blocking
 Sectioning
 Floating
 Staining –(Hematosiklin-Eosin)
 Mounting dan Labelling
TINJAUAN PUSTAKA
 Sectioning
 Proses pemotongan blok preparat dengan menggunakan
mikrotom
 Floating
 Memasukkan obyek glass ke dalam waterbath lalu digerakkan
kearah pita parafin yang akan direkatkan pada obyek glass

 Staining
 Pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong agar unsur
jaringan mudah dikenali pada saat pengamatan dengan
menggunakan mikroskop

  
 Mounting
 Preparat di tetesi dengan entellan lalu ditutup dengan
deck glass

 Labelling
 Ditempelkan label yang berisi nama pasien dan nomor
rekam medis
PRINSIP KERJA

1) Sectioning
 Dengan menggunakan mikrotom
 Tipe : rotary, rocking, sliding, ultra dan lain-lain
 Jenis pisau mikrotom : diamond-kaca dan
disposable (>murah, mudah digunakan,
tajamnya konstan, jenis low/high profile bisa
disesuaikan)
 Untuk jenis rotary mikrotom (di lab PA RSDK) :
 Clearance angle untuk blok parafin 2-4˚ dan FS
5-7˚ 
 Tingkat akurasi dan keamanan tinggi,
produktivitas tinggi serta mudah digunakan
 Diputar 360˚  terpotong secara vertikal
 Ketebalan bisa didapatkan 1-60 mikron
 Bisa manual (lab PA RSDK), semi otomatis dan
full otomatis
 Manual Hand Operation  meningkatkan resiko
terjadinya RMD ( Repetitive Motion Disorder)

Co : carpal tunnel sindrom, bursitis, tendonitis dan


ganglion cyst
 Pemotongan dilakukan dengan memotong blok
paraffin yang telah diletakkan pada holder
 Hingga diperoleh pita-pita paraffin
 Terlalu agresif  moth hole artefak
 Selanjutnya pita paraffin yang telah diperoleh
diletakkan pada waterbath agar jaringan tidak
berlipat saat ditempelkan pada glass objek
 Bila sewaktu pemotongan terasa keras  blok
dihangatkan dengan air hangat ± 30 menit,
mengurangi sudut pisau atau dengan agen pelembut
 Hasil yang baik bila ujung potongan nempel dengan
dengan ujung potongan berikutnya
2) Floating
 Memasukkan pita parafin ± 30 detik dalam waterbath suhu
10˚C dibawah titik cair parafin. (Suhu lab 50˚C)
 Slide juga dimasukkan dalam waterbath lalu digerakkan
kearah bawah pita paraffin sehingga menempel di slide
 Hati-hati terbentuk gelembung gas dibawah pita
 Setelah selesai, dilakukan pengeringan dengan
menggunakan drying oven/hot plate. Durasi tergantung
jenis jaringan, jumlah slide dan ukuran oven. (Di Lab RSDK
10-15 menit dan suhu 70 ˚Celcius).
Tujuannya agar perlekatan menjadi lebih baik dan jaringan
menjadi lebih rata.
 Tidak kering  jaringan bisa terlepas dari slide pada waktu
pewarnaan.
 Kemudian dilakukan transkipsi nomor dari blok ke slide (di
lab PA RSDK secara manual dengan pensil 2b)
 Untuk slide :
 Ukuran 76x25mm, ketebalan 1-1,2mm dan bersih
 Potongan jaringan dapat terlepas mungkin disebabkan :
 Terpapar larutan alkali kuat , potongan cryostat, jaringan CNS
 Terpapar suhu ekstrem, darah dan mukus, dekalsifikasi
 Perekat seperti albumin, gelatin dan kanji bisa digunakan
 Perekat lain : PLL (Poly-L-Lysin), APES (3 Amino Propyltri-
ethoxysilane), charge slide
3) Staining
 Zat warna rutin : Hematoxylin –Eosin (HE)
 2 macam zat warna, yaitu
 hematoksilin : memberikan warna biru ( basofilik) pada
inti sel
 Eosin : memberikan warna merah muda pada sitoplasma
sel dan jaringan penyambung

 Mesin pewarnaan otomatis (tipe dip and dunk


serta X-Y stainer) dan larutan HE serta esoin siap
pakai digunakan secara luas oleh
laboratorium untuk pewarnaan rutin
Tahapan Staining
XYLOL   XYLOL  XYLOL  ALKOHOL 
ETANOL
I 10’ II 10’ III 10’ 1’
96% 1’

I. Deparafinasi 
ALKOHOL  ALKOHOL 
70% 1’ 80% 1’

AQUADEST HE II. Rehidrasi 
ALKOHOL 
1’ 10’
AQUADEST
5’
50% 1’

AQUADEST
1’

ALKOHOL  ALKOHOL 
AQUADEST BLUEING AQUADEST
1’ 5’ 1’
50% 1’
70% 1’

III. Infiltrasi warna
EOSIN
5’

XYLOL  V. Clearing 
III 10’                      IV. Dehidrasi 
  Mounting

XYLOL  ALKOHOL  ALKOHOL  


XYLOL I ETANOL
II 10’ 96% 70% 1’
10’ 1’ 1’
 EOSIN
 Asam flourescent, anionik/muatan negatif, zat warna
xanthene yang mengikat dan membentuk garam
dengan senyawa eosinofilik yang mengandung muatan
positif
 Paling sesuai dikombinasikan dengan hematoksilin untuk
menggambarkan arsitektur histologi umum dari jaringan
 Kebanyakan protein di sitoplasma sel sifat nya basa
karena mengandung arginin dan lisin yang bermuatan
positif, akan berikatan dengan senyawa asam yang
mengandung muatan negatif (co : Eosin) membentuk
warna pink
 Yang tersering digunakan adalah Eosin Y (larut di air dan
alkohol
 Penambahan sedikit asam asetat (0,5 ml dalam 1000cc)
untuk mempertajam pewarnaan
 Hasil yang baik ketika diperoleh pewarnaan Eosin yang
relatif kuat dan diferensiasi yang baik (alkohol 70%) untuk
membedakan sitoplasma dari jenis sel yang berbeda,
serat jaringan ikat dan matriks.
 Co : Orange-pink: Red blood cells
Light pink: Connective tissue
Dark pink: Muscle fibers
Varying shades of pink: Cytoplasm of the cells
 HEMATOKSILIN
 Diperoleh dari ekstrak kayu Hematoxylon campechianum,
berasal dari Campeche, negara bagian Meksiko
 Kandungannya : hematein memberikan pewarnaan, dgn 2
cara :
 Oksidasi alami oleh paparan cahaya dan udara
Waktu 3-4 bulan, kemampuan pewarnaannya bertahan lebih
lama. Co : Ehrlich’s dan Delafield’s hematoksilin
 Proses oksidasi kimia
Dikonversi oleh agen kimiawai, siap pakai segera setelah di
campur.
Co : Mayer’s hematoksilin menggunakan Sodium Iodate
Harris’s hematoksilin menggunakan Mercuric Oxide
Kemampuan pewarnaannya lebih singkat
 Hematein bersifat anionik dan afinitasnya rendah
terhadap jaringan serta tidak adekuat untuk
pewarnaan inti, sehingga perlu ditambahkan
Mordant
 Mordant : bahan kimia sebagai fiksator, dapat
bereaksi dengan zat warna dan berupa logam
kation (muatan positif), co: aluminum, besi dan
tungsten/wolfram
 Hematein + Mordant  larutan hematoksilin
bermuatan positif / basa dan mengikat molekul
asam/anionik/muatan negatif, co : kromatin inti
 HEMATOKSILIN
 Larutan Hematoksilin dibedakan berdasarkan penggunaan
mordant menjadi :
1. Alum Hematoxylins (digunakan di Lab PA RSDK)

2. Iron Hematoxylins

3. Tungsten Hematoxylins

4. Molybdenum hematoxylins

5. Lead Hematoxylins

6. Hematoksilin tanpa mordant


 Alum hematoxylins
 Paling sering digunakan dan menghasilkan pewarnaan inti
sel yang baik
 Mordant yang digunakan : aluminium potassium sulfate
(potash alum) atau aluminium ammonium sulfate
(ammonium alum)
 Inti sel terwarnai merah lalu dikonversi menjadi warna biru
gelap ketika dibilas dengan larutan alkali lemah : air
kran, saturated lithium carbonate, 0.05% ammonia in
distilled water. Proses ini disebut “blueing”
 Bisa digunakan secara progresif atau regresif
 Alum hematoxylins
 Waktu pewarnaan bervariasi tergantung dari jenis
hematoksilin, frekwensi penggunaan, metode
progresif/regresif, pre-treatment dan post-treatment
jaringan.
Co : untuk FS  waktu lebih singkat dan untuk
jaringan dekalsifikasi/terendam dalam NBF dalam
waktu lama waktu pewarnaan lebih lama
 Kelemahan utama  sensitif terhadap asam  dapat
melunturkan warna inti sehingga sedikit yang dapat
dilihat. Dapat diatasi dengan menggunakan iron-
mordanted hematoksilin  lebih resisten terhadap
asam, atau kombinasi dengan celestine blue
 Iron hematoxylins
 Garam besi, biasanya ferric chloride dan ferric ammonium
sulfate, merupakan agen pengoksidasi dan mordant
 Problem utama : oksidasi yang berlebihan, sehingga
pencampuran mordant dan hematoksilin dilakukan segera
sebelum digunakan, co : Weigert’s atau penggunaannya
secara teratur, co : Heidenhain’s dan Loyez
 Memperlihatkan struktur jaringan lebih luas > alum
hematoxylins, tetapi waktu yang diperlukan lebih lama
dan diperlukan kontrol mikroskopik supaya akurat
 Digunakan untuk identifikasi spesifik fosfolipid
 Tungsten hematoxylins
 Tahun 1897, Mallory menggabungkan hematoksilin dengan 1%
aqueous phosphotungstic acid (mordant) disebut PTAH
(Phosphotungstic Acid Hematoxylins), dimana
dimungkinkan penggunaan langsung hematein (tidak
diperlukan proses oksidasi)
 Bila menggunakan hematoksilin, perlu ditambahkan agen
pengoksidasi seperti potassium permanganate (siap
digunakan dalam 24 jam)
 Bila dengan pengoksidasi alami (sinar dan udara) perlu
beberapa bulan untuk matang, tetapi bisa bertahan untuk
beberapa tahun untuk penggunaannya
 Digunakan untuk sampel CNS, struktur jaringan lainnya.
 Molybdenum hematoxylins
 Menggunakan molybdic acid sebagai mordant
 Jarang digunakan untuk pewarnaan sekarang ini
 Teknik Thomas  memperlihatkan kolagen, retikulin kasar
dan granula sel argentaffin

 Lead hematoxylins
 Menggunakan timbal sebagai mordant
 Memperlihatkan granula sel endokrin pada saluran
pencernaan dan regio lain
 Untuk diagnosis identifikasi sel endokrin pada beberapa
tumor
 Sudah digantikan oleh pewarnaan IHC pada saat ini
 Hematoksilin tanpa mordant
 Memperlihatkan berbagai mineral dalam potongan
jaringan
 Percobaan Mallory menunjukkan mineral timbal, besi
dan tembaga pada jaringan tubuh
 Kontrol kualitas pada pewarnaan rutin HE
 Saat ini hampir semua lab menggunakan mesin
pewarnaan otomatis sehingga akurasi dan konsistensi
pewarnaan dapat terjaga
 Tetapi variabilitas dalam larutan pewarna dapat terjadi
dan biasanya lebih sering berhubungan dengan
hematoksilin dibanding eosin
 Variabilitas : batch number, supplier dan perbedaan PH,
juga proses fiksasi, processing, ketebalan potongan dan
pengaturan suhu, variabilitas individu, sering/tidak-nya
penggunaan
4) Mounting
 Setelah proses pewarnaan selesai dilakukan,
preparat di tetesi dengan entellan lalu ditutup
dengan deck glass
 Tujuan dari tahap ini agar preparat lebih tahan lama
dan tidak tergores
 Pada saat preparat ditutup deck glass, harus
dipastikan bahwa tidak ada gelembung yang
terbentuk
5) Labelling
 Pada preparat yang telah diberi cover, ditempelkan
label yang berisi nama pasien dan nomer rekam
medik (di lab PA RSDK dengan No PA)
 Pemberian label penting dilakukan agar diagnosis
pasien yang satu dengan yang lainnya tidak saling
tertukar
KESIMPULAN DAN SARAN
 Di laboratorium PA RSDK untuk proses :
 Trimming
Menggunakan Microtome Rotary manual, untuk
clearance angle bervariasi antara 4-10 derajat
belum optimal untuk mengurangi friksi ketika
pisau melewati blok.
 Transkipsi nomor secara manual dari blok ke slide
ada kemungkinan bisa tertukar dengan yang lain
KESIMPULAN DAN SARAN

 Staining
Menggunakan dip and dunk processor,
kelemahannya :
 Kemampuan menyesuaikan pewarnaan terbatasi
oleh durasi waktu yang sudah ditentukan sebelumnya
 Penggunaan konstan dari reagen yang sama dapat
menyebabkan variasi pewarnaan seiring berjalannya
waktu
 Belum sepenuhnya tertutup maka dapat terjadi
penguapan, kelembaban dan resiko peningkatan
kontak bahan kimia dengan petugas
KESIMPULAN DAN SARAN

SARAN :

1. Mengoptimalkan clearance angel pada penggunaan


mikrotom

2. Dilakukan double check dan triple check pada saat


transkipsi nomor dari blok ke slide

3. Penggunaan APD pada semua tenaga medis yang


berada di laboratorium

4. Modernisasi alat processing laboratorium

5. Tetap melaksanakan SOP laboratorium


REFERENCES

1. Bancroft’s theory and practice of histological


techniques (eighth edition)

2. Normal Histology Linberg Lamps (second


edition)

3. http://www.utas.edu.au/health/community/open-h
ealth/uniview/resources/courses/laboratorymedi
cine/cxa-121-histology-tutorial
(University of Tasmania)

4. SOP RSDK, 2014


 Interaksi antara pewarna dengan jaringan
 Pewarnaan  dapat  terjadi  dikarenakan  adanya  afinitas 
antara pewarna/reagen dengan jaringan
 Beberapa  faktor  yang  berkontribusi  dalam  afinitas  ini 
adalah :
a. Interaksi reagen dengan jaringan, terbagi menjadi
 Coulombic attractions   daya tarik listrik dari muatan positif 
dengan muatan negatif. Co : PAS untuk glikogen
 Van  Der  Waal’s  forces      daya  tarik  antara  satu  molekul 
dengan  molekul  yang  lain  /intermolekul.  Co  :  pewarnaan 
elastic fiber dan Congo red
 Hydrogen  bonding      terjadi  ketika  atom  hidrogen  berada 
diantara  dua  atom  elektronegatif.  Co  :  Sirius  Red  untuk 
kolagen
 Ikatan kovalen  kovalen polar mengikat diantara  ion logam 
seperti mordanting
b. Interaksi antara pelarut dengan pelarut
 Tejadi  hydrophobic  effect    kecenderungan  membentuk 
suatu  kelompok  hidrofobik  di  dalam  lingkungan  berair 
meskipun awalnya tersebar.
Co : pada substrat enzim

c. Interaksi antara reagen dengan reagen
 Membentuk  suatu  agregasi  yang  mempunyai  perbedaan 
spektral dari pewarna monomerik.
Co : pewarnaan metakromatik dengan pewarna basa
A. Proses deparafinasi
 Cara preparat dimasukkan ke chamber 1 (xylol I)  
chamber 2 (xylol II)  chamber 3 (xylol III) masing­
masing 10 menit 
B. Proses rehidrasi
 Masuk ke chamber 4  5 6 7 8 (alkohol 100%, 96%, 
80%,  70%,  50%),  masing­masing  1  menit,  lalu  chamber 
9 (aquades) selama 5 menit
 Tujuan  :  agar  kandungan  air  dalam  jaringan  preparat 
sama dengan pelarut Hematoksilin             ( aquadest ) 
C.  Proses infiltrasi zat warna
 Preparat masuk ke chamber 10 (hematoksilin) selama 10 
menit  chamber 11  12 13 (aquades) masing­masing 
1  menit    chamber  14  tempat  proses  blueing  5  menit 
(menguatkan warna hematoksilin)
 Preparat  masuk  ke  chamber  15  (aquades)  selama  1 
menit    chamber  16    17  (alkohol  50  %  dan  70%) 
,masing­masing selama 1 menit  chamber 18 (eosin­ 
pelarutnya alkohol 70%) selama 5 menit
D. Proses dehidrasi
 Preparat  masuk  ke  chamber  19    20    21  (alkohol 
70 %, 96%, 100%)  masing­masing 1 menit
E. Proses clearing dan mounting
 Preparat  masuk  ke  chamber  22    23  24  (Xylol) 
masing­masing 10 menit
 Untuk  membersihkan  alkohol  dalam  preparat  dan 
sebagai pelekat dengan cover slip