KIMIA TERAPAN

UJI KUALITATIF DOSEN PENGAMPU :

ARDIANSYAH,M.Pd
& KUANTITATIF
PROTEIN DAN
Created by : Rini Rahma Fadila
ASAM AMINO (1605115214)
 UJI KUALITATIF PROTEIN

1. Uji Xantoprotein Tujuan : untuk menunjukkan keberadaan gugus benzen

Langkah kerja :

1 mL sampel (putih telur)

- Tambahkan 3 tetes HNO3 pekat dan

panas 1-2 menit
- Setelah dingin tambahkan tetes demi
tetes NaOH 1 M

Warna kuning tua

 Reaksi

Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang

terdapat pada molekul protein.

NH NH
HO CH2 CH + HNO 3 HO CH2 CH + H2O

C O C O
O 2N

tirosin dalam protein tirosin ternitrasi (kuning tua)

 Tujuan : untuk menunjukkan keberadaan protein yang mengandung
2. Reaksi Hopkins-Cole triptofan

Uji positif : terdapat

cincin ungu pada
batas antara kedua
lapisan

1. Larutan protein yang mengandung triptofan direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole

yang mengandung asam glioksilat.
2. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air.
3. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat
dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein.
4. Beberapa saat kemudian akan terdapat cincin ungu pada batas
antara kedua lapisan tersebut.
 H2
Reaksi H2 H O C H
C C COOH C
+ H C COOH COOH
NH2 C
N N C NH
H H H2
triptofan asam glioksalik kompleks berwarna
violet
Langkah kerja :

1 mL sampel (putih telur)

- Tambahkan 1.5 mL pereaksi Ho Reagen Hopkins-Cole : asam

pkins-Cole oksalat (H2C2O4) ditambah
- Tambahkan 2 mL H2SO4 pekat serbuk Mg dalam 100 aquades

Warna ungu
Protein + Pereaksi Hopkins-Cole + H2SO4 --> Warna Ungu
3. Reaksi Millon Tujuan : untuk mengetahui adanya gugus aromatik
pada protein.

Pereaksi : Millon Langkah kerja :

Uji positif : Terdapatnya
endapan berwarna merah 2 Ml Larutan Protein

Ditambahkan 2-3 tetes

Pereaksi Millon
Larutan merkuro + merkuri nitrat dalam asam nitrat
Dihasilkan
 Reaksi ini positif untuk Fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa
merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Endapan putih
 Gugus hidroksifenil (-C6H4OH) pada tirosin merupakan gugus sasar
an dalam pengujian ini. Uji Millon ditujukan untuk tirosin yang ter Dipanaskan
dapat pada protein.
Gumpalan atau endapan
Merah
REAKSI
4. Reaksi Natriumnitroprusida

Untuk menguji protein yang mengandung

sistein

Langkah kerja :

Pereaksi Natriumnitroprusida

Ditambahkan

Larutan Protein

Dihasilkan

Larutan merah
Reaksi Percobaan
5. Sakaguchi
Pereaksi : naftol dan natriumhipobromit.

Tujuan : untuk mengetahui adanya

gugus Guanin atau arginin pada protein.

Langkah kerja :

Naftol atau natriumhipobromit

Ditambahkan

Larutan Protein

Dihasilkan

Larutan merah
6. Uji Biuret Tujuan : untuk mengetahui adanya g u g u s a m i d a a s a m
yang terikat dengan gugus amida yang lain

Langkah kerja :
Uji positif : ditandai dengan
endapan berwarna merah timbulnya
warna merah violet atau biru violet Larutan Protein
Ditambahkan

NaOH

Ditambahkan

CuSO4 encer

Dihasilkan

Larutan warna merah

violet atau biru violet
REAKSI
Prosedur Metode Biuret

1 mL sampel (putih telur)

- Tambahkan 3 tetes CuSO4 1 %

- Tambahkan 1 mL NaOH 0.1 M
- Campurkan dengan baik

Warna ungu (violet)

7. Uji Ninhidrin Digunakan untuk identifikasi asam amino.

Hasil positif : diberikan oleh pepton,

asam amino, dan amino primer lain,,
termasuk amoniak.

 Menyebabkan terjadinya dekarboksilasi oksidatif asam amino untuk men

ghasilkan CO2.NH2 dan suatu aldehid dengan suatu atom karbon kurang
daripada asam amino induknya.
 Ninhidrin yang terduksi dan bereaksi dengan amino lepas membentuk ko
mpleks biru-ungu yang maksimal menyerap cahaya dengan panjang gelo
mbang 570 nm.
 REAKSI

O O
O_
C C O
OH C
H - H2O
C + R C COOH C N C + R C OH

C OH NH2 C C

O -asam amino O O
senyawa komplek
ninhidrin berwarna
Prosedur Kerja

2 mL sampel (putih telur)

- Tambahkan 0.5 mL larutan ninhidrin

(0.1%)
- Panaskan selama 10 menit

Warna biru - ungu

8. Uji Belerang

 Jika larutan protein dididihkan dengan campuran larutan KOH atau NaOH
dan Pb-asetat, endapan berwarna hitam akan terbentuk jika terdapat asam a
mino yang mengandung sulfur (misalnya sistein dan metionin).
 Larutan basa kuat memutus ikatan sulfur pada asam amino, membentuk K2
S, yang dengan Pb-asetat membentuk PbS, senyawa berwarna hitam.
 Metionin tidak positif dengan uji ini kecuali jika larutan potein dipanaskan
terlebih dahulu dengan asam mineral.
Reaksi

O O
NH HC C NH CH C
CH 2SH oksidasi
H2C S
H2C S ikatan disulfida
CH 2SH reduksi
NH CH C NH CH C
O O

2 residu sisteina residu sistina

Prosedur Uji belerang

1 mL sampel (putih telur)

- Tambahkan 0.5 mL NaOH 6 M dan panas 2 menit

- Setelah dingin tambahkan 2 mL CH3CHOOH 3 M
- Tutup tabung reaksi dengan kertas saring yang dibasahi
Pb(CH3COO)2 dan dipanaskan lagi

Warna hitam
9. Uji Pauly Diazo

Tes ini khusus untuk mendeteksi Tryptophan atau Histidin. Reagen yang digunakan untuk tes
ini mengandung asam Sulphanilic dilarutkan dalam asam klorida. Sulphanilic asam pada diazoti
sasi dengan adanya natrium nitrit dan hasil asam klorida dalam pembentukan garam diazoniu
m. The diazonium garam yang terbentuk pasangan dengan baik tirosin atau histidin dalam me
dium alkali untuk memberikan chromogen berwarna merah (zat warna azo).
9. Folin di McCarthy Sullivan

Asam amino seperti prolin dan hidroksiprolin mengembun dengan isatin reagen dalam kondisi
basa untuk menghasilkan adduct berwarna biru. Selain natrium nitroprusside [Na2Fe (CN) 5N
O] untuk larutan alkali metionin diikuti oleh pengasaman reaksi menghasilkan warna merah.
Reaksi ini juga membentuk dasar untuk penentuan kuantitatif metionin.

10. Tes Isatin

Asam amino seperti prolin dan hidroksiprolin mengembun dengan isatin reagen dalam kondisi basa
untuk menghasilkan adduct berwarna biru.
 UJI KUANTITATIF PROTEIN

1. Metode Kjeldahl

Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitroge

n total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitro
gen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katal
isator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah
pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap sec
ara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.
2. Metode Titrasi Formol

• Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk
dimethilol.
• Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempeng
aruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat.
Indikator yang digunakan adalah PP
• Akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam
30 detik.
3. Metode Lowry
Prosedur :
• Pembuatan reagen Lowry A : Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolib
dat dengan perbandingan (1 : 1)
• Pembuatan reagen Lowry B :Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium
hidroksida 0,1N. Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% da
n 1 ml kalium natrium tartrat 2%.

a. Pembuatan kurva baku.

Siapkan larutan bovin serum albumin dengan konsentrasi 300 µg/ml (Li). Buat seri konsentrasi dalam
tabung reaksi, misal dengan komposisi berikut : Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml rea
gen Lowry B dan biarkan selama 10 menit, kemudian tambahkan 1 ml reagen Lowry A. Kocok dan bia
rkan selama 20 menit. Baca absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm tehadap blanko. (Seba
gai blanko adalah tabung reaksi no.1 pada tabel di atas)
b. Penyiapan Sampel.
Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penam
bahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendek
ati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus
11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudi
an dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil volume tertentu d
an lakukan penetapan selanjutnya seperti pada kurva baku mulai dari penambahan 8 ml reagen Lowr
y A sampai seterusnya.
4. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)

a. Pembuatan reagen Biuret :

Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O)
dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% s
ambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades sampai garis tanda. Pembuatan larutan induk b
ovin serum albumin (BSA): Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades sampai
10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li).

b. Penetapan kadar (Metode Biuret)

Pembuatan kurva baku : Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen Biuret dan aquades misal de
ngan komposisi sebagai berikut: Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada ë 550 nm terhadap blan
ko yang terdiri dari 800 µL reagen Biuret dan 200 µL aquades.
c. Cara mempersiapkan sampel
Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penam
bahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendek
ati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.
000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian
dilarutkan kembali dengan asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil sejumlah µL larutan tersebu
t secara kuantitatif kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar asetat pH
5 untuk pengukuran kuantitatif. Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansiny
a pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5.
Perhatikan adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam ki
saran absorban kurva baku.
5. Metode Spektrofotometri UV

Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai g
ugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempun
yai absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelo
mbang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein
dalam larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan
pengukuran absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontamina
si oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel.
THANK YOU 