Analisis

Karbohidrat
Analisis
kualitatif Analisis
A. Menggunakan pereaksi kimia kuantitatif
1. Uji Molisch
2. Uji Benedict A. Secara fisika
3. Uji Fehling 1. Berdasarkan indeks bias
4. Uji Barfoeds 2. Berdasarkan rotasi optik
5. Uji Bial
6. Uji Iodine B. Secara Kimia
7. Uji Osazone 1. Spektrofotometri
8. Uji Seliwanoff 2. Metode Somogyi-Nelson
3. Metode Dinitrosalsilat (DNS)
B. Menggunakan instrument
1. Gas Chromatography (GC) C. Enzimatik
2. High pressure liquid
chromatography (HPLC)
 1. Uji Molisch

Tujuan : untuk mengetahui ada tidaknya karbohidrat dalam sampel

Prinsip :
Uji ini didasari oleh reaksi dehidrasi karbohidrat oleh asam
sulfat membentuk cincin furfural , kemudian senyawa furfural
lalu terkondesasi dengan alfa-naftol yang tersulfonasi
membentuk warna keunguan.
 1. Uji Molisch
Reagan :
H2SO4 dan Molisch’s reagent (alfa-naftol 5% dalam
95 % etanol)
Prosedur :

1.Ambil 2 ml larutan karbohidrat dalam tabung reaksi yang bersih dan kering.
2. Tambahkan 2 tetes etanol Naphthol (pereaksi Molisch) dan aduk.
3. Miringkan tabung reaksi dan tambahkan dengan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat di
sepanjang sisi tabung reaksi sehingga membentuk 2 lapisan

Adanya warna ungu menandakan tes

molisch positif
 2. Uji Benedict
Tujuan : untuk mengetahui adanya Gula pereduksi (semua monosakarida dan
disakarida kecuali fruktosa)
Prinsip :
• Karbohidrat dengan gugus aldehida atau keton bebas memiliki kemampuan untuk
mereduksi berbagai larutan ion logam
• Reduksi gula pada suasana basa akan mengalami taumerisasi dan membetuk
enediol
• Enediol akan mereduksi Cu2+ menjadi Cu+
• Ion Cu+ bergabung dengan ion OH- untuk membentuk CuOH berwarna kuning yang
pada pemanasan diubah akan menjadi Cu2O berwarna merah bata
 2. Uji Benedict
Reagan :
Natrium bikarbonat anhidrat, natrium sitrat, dan
Prosedur : tembaga (II) sulfat pentahidrat (Cu2+)

1.Ambil 5 ml larutan peraksi benedict (berwarna biru)

2. Tambahkan 8 tetes larutan karbohidrat
3. Didihkan diatas api selama 2 menit atau menggunakan water bath selama 5 menit
,lalu dinginkan

Uji Negatif Uji Positif

(Sumber: nku.edu)
 2. Uji Benedict

Tes Benedict adalah tes semi kuantitatif. Warna yang terbentuk tergantung pada jumlah
gula reduksi yang ada dalam campuran

Warna hijau : < 500 mg/dL

Endapan hijau : 500 - 1000 mg /dL
Endapan kuning : 1000 – 1500 mg/dL
Endapan jingga : 1500 – 2000 mg/dL
Endapan merah bata : > 2000 mg/dL
 3. Uji Fehling

Tujuan : untuk mengetahui adanya Senyawa karbohidrat dengan gugus aldehida

(gula aldosa)

Prinsip :
Prinsip dari metode fehling yaitu menggunakan gugus aldehid pada gula untuk
mereduksi senyawa Cu2SO4 menjadi Cu2O (endapan berwarna merah bata) setelah
dipanaskan pada suasana basa (Benedict dan Fehling) atau asam (Barfoed) dengan
ditambahkan agen pengikat (chelating agent) seperti Na-sitrat dan K-Na-tatrat.
 3. Uji Fehling
Reagan :
Fehling A : tembaga (II) sulfat
Prosedur : Fehling B : NaOH dan KNa-tartrat (garam Rochelle)

1. Masukkan 8 -10 tetes larutan sampel ke dalam tabung reaksi

2. Masukan 5 mL pereaksi fehling
3. Panaskan menggunakan water bath selama 5 menit ,lalu dinginkan

Kiri: Larutan Fehling A+B control

Kanan: Hasil positif uji Fehling

sumber: chemdemos.uoregon.edu
 4. Uji Barfoed

Tujuan : untuk membedakan monosakarida dan disakarida

Prinsip :
Aldosa dan ketosa dapat mengurangi ion tembaga bahkan dalam kondisi asam.
Pada suasana asam reaksi oksidasi akan lama terjadi. Tes ini digunakan untuk
membedakan reduksi monosakarida dan disakarida dengan mengendalikan pH
dan waktu pemanasan. Monosakarida bereaksi sangat cepat sedangkan
disakarida bereaksi sangat lambat
 4. Uji Barfoed
Reagan :
Tembaga (II) di dalam medium agak asam [pH < 7]
Prosedur :
1. Masukkan 2 ml perekasi barfoed ke dalam tabung reaksi dan tambahkan 2 ml
larutan uji
2. Panaskan menggunakan water bath selama 3 menit
3. Lalu dinginkan di dalam air

Adanya endapan merah bata menandakan adanya

monosakarida didalam sampel tersebut . Pada disakarida
juga akan terbentuk endapan merah bata apabila dilakukan
pemanasan lebih lama

(Sumber: http://www.medbiochemistry.com)
 5. Uji Bial

Tujuan : untuk mengetahui adanya gula pentosa

Prinsip :
Gula pentosa dipanaskan bersama HCl akan terhidrolisis menghasilkan furfural,
lalu terkondensasi dengan orsinol (3,5-dihidroksitoluena) menghasilkan senyawa
kompleks berwarna biru kehijauan.
 5. Uji Bial
Reagan :
Larutan orcinol di dalam HCl terkonsentrasi dengan
tambahan ferri-klorida
Prosedur :
1. Masukkan 2 mL larutan uji
2. Tambahkan 2 mL pereaksi Bial
3. Panaskan menggunakan water bath atau bunsen

Tes ini khusus untuk pentosa. Heksosa

umumnya bereaksi membentuk senyawa
hijau, merah, atau cokelat

(Sumber: http://www.medbiochemistry.com)
 6. Uji Iodine
Tujuan : untuk mengetahui adanya Polisakarida

Prinsip :
Kondensasi iodin dengan polisakarida pada uji iodin, dapat menghasilkan warna
yang khas. Hal ini disebabkan karena dalam polisakarida, terdapat unit-unit
glukosa yang membentuk rantai heliks karena adanya ikatan dengan konfigurasi
pada tiap unit glukosanya. Bentuk ini menyebabkan polisakarida dapat
membentuk senyawa kompleks dengan molekul iodium yang dapat masuk ke
dalam spiralnya, sehingga menyebabkan warna biru tua pada kompleks tersebut

(Sumber: http://chemistry.elmhurst.edu/)
 6. Uji Iodine
Reagan :
Iodida (I2) yang dilarutkan di dalam KI membentuk
kompleks ion triiodida (I3-)
Prosedur :
1. Masukkan 1 mL larutan pati 1 %
2. Tambahkan 2 tetes larutan iod
Warna yang diperoleh tergantung pada
panjang rantai tidak bercabang atau linier
yang tersedia untuk pembentukan kompleks

Amilosa : Komponen rantai linear dari

pati,memberikan warna biru tua
Amilopektin : Komponen rantai pati
bercabang, memberikan warna
ungu
Glikogen : Memberikan warna coklat
kemerahan
tidak berubah warna untuk monosakarida /
(Sumber: http://www.sciencephoto.com)
disakarida
 7. Uji Osazon
Tujuan : mengidentifikasi karbohidrat berdasarkan bentuk kristalnya

Prinsip :
karbohidrat dengan gugus aldehida atau keton bebas membentuk hidrazon
atau osazon bila dipanaskan bersama fenilhidrazin berlebih
 7. Uji Osazon

Prosedur :
• Campurkan fenil hidrazin Na asetat kering dengan 5 ml larutan percobaan.
• Kocok dan panaskan di dalam penangas air, kemudian didinginkan
• Periksa endapan dibawah mikroskop.

Setiap gula pereduksi memiliki struktur yang

berbeda

Laktosa : kristal puffed-shaped

Maltosa : kristal petal-shaped
Galaktosa : kristal phombi-plate

(Sumber: slideshare.net)
 8. Uji Seliwanoff
Tujuan : mengetahhui adanya gula ketosa

Prinsip :
Dehidrasi ketosa oleh HCl pada reagen menjadi 4-hidroksi metal furfural, lalu
terkondensasi dengan resorcinol membentuk senyawa kompleks berwarna
merah ceri
 8. Uji Seliwanoff
Reagan :
Resorsinol dan HCl pekat

Prosedur :
1. Masukkan 1 mL larutan uji lalu tambahkan 3 ml Reagan seliwanoff
2. Panaskan selama 30 detik
3. Lalu dinginkan

Tes ini diberikan positif oleh ketoheksosa sehingga

uji positif ditemukan pada fruktosa, sukrosa dan
karbohidrat mengandung fruktosa lainnya.

(Sumber: seilnacht.info)
 GCMS dan HPLC

❑Dapat menggunakan GC (gas chromatography) dan HPLC (high

performance liquid chromatography).
❑Jika menggunakan GC, sampel harus diturunkan ke dalam bentuk
yang volatile.
❑Misal, dalam bentuk asam aldonate diubah dahulu menjadi trimetilsilil
(TMS) untuk kemudian disuntikkan ke dalam kromatograf.
 GCMS dan HPLC

❑Bila menggunakan HPLC, sampel tidak perlu diturunkan.

❑Namun, pada beberapa kasus, polisakarida harus dihidrolisis terlebih
dahulu sebelum dimasukkan ke dalam instrument.
❑Baik menggunakan GC atau HPLC, analisis dilakukan dari peak grafik
yang dihasilkan instrumen.

LC-kromatogram dari sampel standar

beberapa jenis karbohidrat
Analisis Kuantitatif
 A. Secara Fisika
1. Indek Bias

 menggunakan alat yang dinamakan refraktometer, alat ini

Memanfaatkan refraksi cahaya (pembiasan)
 Gugus glukosa atom C mengenai prisma akan dibiaskan. Semakin
besar indeks bias semakin besar konsentrasi materi

Menggunakan Rumus :
X = [(A+B)C - BD)]
Dimana :
X = % sukrosa atau gula yang diperoleh
A = berat larutan sampel (g)
B = berat larutan pengencer (g)
C = % sukrosa dalam camp A dan B dalam tabel
D = % sukrosa dalam pengencer B –ut batas antara
cairan dan alas.
 2. Rotasi Optis

• Menggunakan polarimeter.
• Didasarkan prinsip bahwa gula memiliki struktur asimetri yang
dapat memutar bidang optik.
• Hukum Biot “Besarnya rotasi optis tiap individu gula sebanding
dengan konsentrasi larutan dan tebal cairan.”
Persamaan Hukum Biot untuk
polarimeter
 B. Secara kimia
1. Spektrofotometri

❑ Didasarkan atas absorbansi cahaya oleh larutan

sampel.
❑ Sebagai contoh, gula pereduksi direaksikan
dengan CuSO4 dan ditambahkan Na-sitrat dan
Na-tartrat membentuk kompleks senyawa biru.
Hasilnya dapat diukur spektrofotometer pada
panjang gelombang ~ 630 nm. Spektrofotometer UV-VIS
(Sumber: shimadzu.com)
 2. Metode Nelson-Somogy

• Tujuan: mengukur kadar gula reduksi dengan menggunakan

pereaksi tembaga arseno molibdat
• Prinsip: oksidasi dengan kupri

Kupro yang terbentuk Membandingkan- Reaksi warna yang

Kupri direduksi dilarutkan dengan terbentuk dapat
nya dengan larutan
menjadi bentuk arseno molibdat menentukan
standar sehingga
kupro dengan menjadi molybdenum konsentrasi gula
pemanasan berwarna biru yang
konsentrasi gula dalam sampel
larutan gula menunjukkan ukuran dalam sampel dengan mengukur
konsentrasi gula dapat ditentukan absorbansinya
 3.Metode Dinitrosalisilat (DNS)

❑ Tujuan: mengukur satu jenis gula pereduksi dengan Teknik kolorimetri

❑ Prinsip: gugus fungsi (mis. aldehid) pada gula dioksidasi oleh asam 3,5-
dinitrosalisilat menjadi gugus karboksil dan menghasilkan asam 3-
amino-5-salisilat pada kondisi basa pada suhu 90-100oC.
❑ Larutan akhir dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm.
❑ Nilai pengukuran yang diperoleh diplot pada kurva standar.

Reaksi DNS dengan gula pereduksi

 C. Metode Enzinatis

 Bergantung pada kemampuan enzim mengkatalisis reaksi spesifik.

 Dua metode umum:
Mengukur konsentrasi produk yang proporsional terhadap konsentrasi substrat
awal, dan
Mengukur laju awal reaksi yang dikatalisis enzim.
 Sakarida yang lazim dianalisis dengan metode ini adalah d-glukosa/fruktosa
dan maltosa/sukrosa.
 Pada d-glukosa/fruktosa, gula dikonversi menjadi G6P dengan heksasinosa. G6P
dioksidasi oleh NADP+ dan salah satunya menghasilkan NADPH. Banyaknya
NADPH proporsional terhadap G6P dan dapat diukur menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang = 340 nm.