STUDI PENGARUH TERAPI AIR ALKALI TERHADAP AKTIVITAS ENZIM

PROTEASE DAN GAMBARAN HISTOPATOLOGI HEPAR

TIKUS (Rattus norvegicus) MODEL INFLAMMATORY
BOWEL DISEASE (IBD) HASIL INDUKSI
INDOMETASIN

Feby Ferdina
125130101111067

Pembimbing : Penguji :
1. Dr. Sasangka Prasetyawan, MS 1. drh. Dian Vidiastuti, M.Si
2. drh. Dyah Ayu OAP., Mbiotech 2. drh. Wawid Purwatiningsih, M.Vet

Fakultas Kedokteran Hewan – Universitas Brawijaya

 LATAR BELAKANG

Pada 1 Agustus 2003 sampai 31

Inflammatory Bowel Disease (IBD)
Desember 2009 tercatat kasus
merupakan suatu kondisi inflamasi
Inflammatory Bowel Disease terjadi
kronik di saluran pencernaan (Kumar
pada 546 anjing dengan 86 ras yang
et al., 2005).
berbeda (Kathrani et al, 2011)
 LATAR BELAKANG

EFEK YANG TERJADI PADA HEPAR SEHINGGA DI PERLUKAN TERAPI ALTERNATIF

YAITU MENGGUNAKAN AIR ALKALI
 LATAR BELAKANG

Air alkali memiliki pH basa

Nilai oxidation reducion
potensial (ORP) negatif
molekul micro-cluster
Antioksidan
 RUMUSAN
MASALAH

Bagaimana pengaruh terapi air alkali terhadap aktivitas

enzim protease hepar tikus (Rattus norvegicus) model
Inflammatory Bowel Disease (IBD) hasil induksi
indometasin?

Bagaimana pengaruh terapi air alkali terhadap gambaran

histopatologi hepar tikus (Rattus norvegicus) model
Inflammatory Bowel Disease (IBD) hasil induksi
indometasin?
 T U J UA N
PENELITIAN

Mengetahui pengaruh terapi dari air alkali dalam

penurunan aktivitas enzim protease pada hepar
tikus model Inflammatory Bowel Disease (IBD)

Mengetahui pengaruh terapi air alkali dalam

memperbaiki gambaran histopatologi hepar
tikus model Inflammatory Bowel Disease (IBD)
Batasan Masalah
Hewan model yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar, umur 8-12
minggu dengan berat badan 150-200 gram yang di peroleh dari Unit Pengembangan Hewan
Percobaan (UPHP) UGM, Yogyakarta
Air alkali yang digunakan merupakan air yang didapatkan dari pabrikan melalui proses elektrolisis.

Pembuatan keadaan Inflammatory Bowel Disease (IBD) pada hewan model tikus dilakukan dengan
cara pemberian indometasin sebanyak 15 mg/kg BB secara per oral sebanyak 1 kali pada hari ke-1
(Aulanni’am et al., 2012).

Volume Air Alkali yang digunakan adalah 1 ml/ekor dan 2 ml/ekor secara per oral serta diberikan 2
kali sehari selama 7 hari.

Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah dengan melihat penurunan aktivitas enzim
protease dengan metode spektrofotometri serta perbaikan gambaran histopatologi hepar secara
mikroskopis dengan menggunakan pewarnaan HE.
 M A N FA AT
PENELITIAN

Penelitian ini dapat

digunakan untuk
mengetahui pengaruh air
alkali sebagai anti- Penelitian ini dapat
inflamasi pada tikus putih digunakan sebagai
(Rattus norvegicus) hasil Informasi dalam kajian
induksi indometasin ilmiah tentang manfaat
terhadap penurunan air alkali sebagai terapi
aktivitas enzim protease Inflammatory Bowel
di hepar dan perbaikan Disease (IBD)
gambaran histopatologi
hepar
Sertivikat Laik Etik
Indometasin Tikus (Rattus norvegics)

Menghambat COX-1
K
Menghambat sintesis prostglandin E
Aktivasi makrofag
R
A
Air Alkali sebagai
Produksi ROS
antioksidan N
Aktivasi Nf-KB G
K
Sitokin Pro-Inflamasi
A
Inflamasi Usus (IBD)
K
Vena Porta
O
Hepar N
Aktivitas Neutrofil
S
E
Aktivitas Enzim Protease
P
Kerusakan Sel Hepar Histopatologi Hepar
 Hipotesis Penelitian

Pemberian air alkali mampu menurunkan

aktivitas enzim protease pada hepar tikus
(Rattus norvegicus) model Inflammatory
Bowel Disease

Pemberian air alkali mampu memperbaiki

gambaran histopatologi pada hepar tikus
(Rattus norvegicus) model Inflammatory
Bowel Disease
 Waktu dan Tempat

Waktu
Januari 2016 - April 2016

Tempat
1. Laboratorium Biosains Universitas
Brawijaya Malang
2. Laboratorium Biokimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Brawijaya Malang

Fakultas Kedokteran Hewan – Universitas Brawijaya

 Estimasi Besar Sampel
Estimasi besar sampel

p (n-1) ≥ 15
4 (n-1) ≥ 15
4n-4 ≥ 15
4n ≥ 19
n ≥ 4,75
n ≥5

Keterangan :
p = jumlah kelompok perlakuan
n = jumlah ulangan yang diperlukan
 Variabel Penelitian

Variabel bebas Variabel Tergantung Variabel kontrol

Induksi indometasin dan

terapi air alkali Histopatologi hepar dan
aktivitas protease Tikus (umur, strain, jenis
kelamin dan pakan) serta
kondisi eksperimental
 Tikus Aklimatisasi selama 7 hari

Kelompok 1, Kelompok 2, Kelompok 3, Tikus Terapi 1 Kelompok 4, Tikus Terapi K

Tikus Sehat Tikus Sakit 1 ml/ekor 2 ml/ekor E
(Kontrol) (IBD)
R
Hari 1 Hari 1 Hari 1
A
Induksi Indometasin Induksi Indometasin (Inkubasi 1 hari)
(Inkubasi dan pakan standar N
Pakan standart
1 hari) G
dan pakan standar Hari ke-2 sampai ke-8
K
Terapi air alkali 1 ml/ekor Terapi air alkali 2 ml/ekor A
(2 kali sehari) (2 kali sehari)
Hari ke-1 Hari ke-2 Hari ke-9 Hari ke-9
O
Dislokasi leher  Pembedahan Tikus P
E
Isolasi Organ Hepar R
A
S
Pembuatan Preparat I
O
Pewarnaan HE Spektrofotometri
N
A
Preparat Histopatologi Aktivitas Protease
L

Analisis Data
 Analisa Data
Data
Kualitatif
Perubahan gambaran histopatologi hepar
tikus dengan pewarnaan HE kemudian akan
dianalisis dan disajikan secara deskriptif
Data
Kuantitatif
Mengetahui aktivitas enzim protease dengan spektofotometri
yang akan dianalisis dan disajikan dengan Uji ANOVA dan uji
lanjutan BNJ dengan α = 0,05 untuk mengetahui perbedaan
antar perlakuan.
Hasil Penelitian
 Aktivitas Protease

Aktivitas protease hepar tikus (Rattus novergicus) yang dipapar indometasin dan
pasca diterapi dengan air alkali
Kelompok Rata-Rata Peningkatan Penurunan
Aktivitas Protease Aktivitas Protease Aktivitas Protease
(µmol/ml.menit) Terhadap Kontrol Terhadap Kontrol
Negatif (%) Positif (%)

Kontrol Negatif 0,016 ± 0,001a - -

Kontrol Positif 0,056 ± 0,003d 250 -

Terapi Air Alkali 0,045 ± 0,002c - 19,64

(1 ml/ekor)
Terapi Air Alkali 0,023 ± 0,003b - 59,35
(2 ml/ekor)
Keterangan : Perbedaan notasi a, b, c dan d menunjukkan adanya perbedaan yang
signifikan (p<0,05) antara kelompok perlakuan.
Aktivitas Protease
Persentasi Peningkatan Aktivitas Protease terhadap Kontrol

  % Aktvitas Protease = x 100 %

= x 100%

= 250 %

Persentasi Penurunan Aktivitas Protease

  1. Perlakuan tikus terapi dengan pemberian terapi air alkali 1 ml/ekor

= 19,64 %

  2. Perlakuan tikus terapi dengan pemberian terapi air alkali 2 ml/ekor

= 59,35 %
 Gambaran Histopatologi Hepar
A B
B

3
ii
4 Keterangan:
1
VS
VS [A] Tikus kontrol
VC
VS
VS 5 negatif
[B] Tikus kontrol positif
i
[C] Tikus terapi 1
2 ml/ekor
[D] Tikus terapi 2
ml/ekor
C D VS = Vena Sentralis
1 = sel hepatosit normal,
2 = sinusoid normal
1
3 = dilatasi sinusoid
4 = karioreksis
4 VS
VS VS 5 = piknotik
huruf i (insert) =
3
2 menunjukkan sel
hepatosit yang diperbesar
i
KESIMPULAN
Pemberian terapi air alkali mampu
menurunkan aktivitas enzim protease
pada tikus (Rattus norvegicus) model
Inflammatory Bowel Disease (IBD) serta
volume pemberian 2 ml/ekor merupakan
volume pemberian terbaik yang mampu
menurunkan aktivitas enzim protease
sebesar 59,35%.
Pemberian terapi air alkali mampu
memperbaiki histopatologi organ
hepar tikus (Rattus norvegicus)
model Inflammatory Bowel
Disease (IBD) melalui perbaikan
sel hepatosit dan sinusoid
 SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut

dengan memperpanjang lama terapi
untuk mengetahui efek lebih luas
tentang penggunaan air alkali serta
perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
tentang kandungan dari air alkali.
T E R I M A

K A S I H
 Perhitungan Dosis

 Perhitungan Dosis Indometasin

Pemberian dosis indometasin untuk IBD adalah 15 mg/kg BB (Aulanni’am, 2012), maka perhitungan dosis
indometasin yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
Kebutuhan indometasin = 15 mg/kg BB x 0,18 kg = 2,7 mg/ekor
Kebutuhan indometasin per kandang = 2,7 mg/ekor x 5 ekor = 13,5 mg
Kebutuhan indometasin keseluruhan = 13,5 mg/ekor x 3 kandang = 40,5 mg

 Pembuatan Stok Indometasin

Pembuatan stok indometasin yaitu indometasin yang telah dihitung dosisnya kemudian dilarutkan dengan
minyak jagung steril. Dosis indometasin 2,7 mg/ekor dilarutkan dengan minyak jagung sebanyak 200
µL, sehingga kebutuhan minyak jagung untuk melarutkan indometasin keseluruhan kandang adalah:
= 3 kandang x 5 ekor x 200 µl
= 3000 µl
= 3 ml
Isolasi Protein
Organ Hepar

polipropilen
Diagram Kerja Pengukuran Aktivitas Protease
Diagram Kerja Pengukuran Aktivitas
Protease
Mikroskop
Aktivitas Protease dengan
spektrofotometri

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang

didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis
oleh suatu larutan berwarna pada panjang gelombang
spesifik.
 Pembuatan Preparat Histologi
1. Pengambilan sampel hingga Embedding Hepar
Tikus dibedah

-diambil organ hepar

-dimasukkan dalam paraformaldehide (PFA) 4%
-diambil dan direndam dalam etanol 70% selama 24 jam
-dimasukkan dalam etanol 80% selama 2 jam
-dimasukkan dalam etanol 90% selama 20 menit
-dimasukkan dalam etanol 95% selama 20 menit
-dipindahkan dalam etanol absolut selama 3 x 30 menit pada suhu ruang
-dimasukkan dalam larutan xylol I selama 60 menit pada suhu ruang
-dimasukkan dalam larutan xylol II selama 60 menit pada suhu 60- 630C
-dimasukkan dalam larutan xylol III selama 60 menit pada suhu inkubator
-dicelupkan ke dalam parafin cair selama 3 x 60 menit pada suhu 56- 580C

Hepar dalam blok parafin

2. Pembuatan Preparat Organ Hepar

Hepar dalam blok parafin

-diiris dengan ukuran 4μm

-didinginkan pada suhu ruang
-dimasukkan dalam air hangat pada suhu 37oC
-diambil dan ditempatkan pada gelas objek
-preparat hepar disimpan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam

Preparat siap pewarnaan

 Pembuatan Preparat Histologi

3. Pewarnaan Hematoksilin Eosin

Preparat Hepar

-dideparafinasi dengan xylol selama 5 menit

-dimasukkan dalam etanol absolut selama 5 menit
-dimasukkan dalam etanol 95% selama 5 menit
-dimasukkan dalam etanol 90% selama 5 menit
-dimasukkan dalam etanol 80% selama 5 menit
-dimasukkan dalam etanol 70% selama 5 menit
-dicuci dengan menggunakan air mengalir selama 15 menit
-direndam dalam akuades steril selama 5 menit
-diwarnai dengan Hematoksilin selama 10 menit
-dicuci dengan menggunakan air mengalir selama 30 menit
-dibilas dan direndam dengan akuades steril selama 5 menit
-diwarnai dengan menggunakan Eosin selama 5 menit
-dicuci kembali dengan menggunakan air mengalir selama 10 menit
-dibilas dengan akuades selama 5 menit
-dimasukkan dalam etanol 70% selama 10 menit
-dimasukkan dalam etanol 80% selama 10 menit
-dimasukkan dalam etanol 90% selama 10 menit
-dimasukkan dalam etanol 95% selama 10 menit
-dimasukkan dalam etanol absolut 3 x 5 menit
-dimasukkan dalam larutan xylol 2 x 5 menit
-dikeringkan dengan cara dianginkan
-dimounting dengan menggunakan antellan
-ditutup dengan cover glass

Preparat Hepar pewarnaan

HE
Air Alkali
 Air Alkali

Gambar 2.3 Electrochemical preparation of reduced water, mineral nanoparticles and mineral hydrides
(Shirahata et al., 2012).

Keterangan: A. Secara elektrokimia air direduksi di sekitar katoda adalah air yang kaya dengan molekul hidrogen
sedangkan air dioksidasi di sekitar anoda mengandung gas oksigen, gas klorida, dan asam hipoklorit jika dalam air
mengandung ion Cl. B. Terjadi reaksi pada permukaan platinum elektroda. Proton yang lepas dari air direduksi
menjadi atom H teradsorbsi (Had) pada permukaan pelat platinum. Had diubah menjadi atom H2. Had diserap ke
dalam logam Pt untuk menghasilkan H terarbsorbsi (H ab). Ion mineral dalam original water direduksi menjadi
atom logam dan kemudian terorganisir membentuk mineral nanopartikel. Mineral nanopartikel dilindungi oleh
pelindung organik yang stabil dan tersebar di dalam air untuk waktu yang lama. Mineral nanopartikel adsorb atau
atom H terarbsorbsi dengan adanya H2- atau H-donor.
Air Alkali
Anatomi Hepar Tikus
Histologi Hepar Tikus
Hewan Uji
Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor 7 Tahun 2014 Tentang Pedoman Uji
Toksisitas Nonklinik Secara In Vivo
 HASIL STATISTIK
Uji Kenormalan menggunakan SPSS

Uji Homogenitas
 HASIL STATISTIK
UJI ANOVA
 HASIL STATISTIK
Uji BNJ/ Tukey’s Procedure HSD
HASIL STATISTIK
Gambar sonde lambung
Sitokin
Sitokin
Heksagonal
Proses Fagositosis
Perbedaan Nekrosis dan Apoptosis