Oleh: Mulyawan Arisyuada

Institut Sains dan Teknologi Al’Kamal

Kromatografi Kolom Terbuka

Sistem pemasukan sampel: manual, tidak

Color volumetrik  Injector
Waktu analisis lama, mengandalkan gaya
grafitasi dan kapiler  pompa
Hasil pemisahan kurang baik  pengemasan
kolom
Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk
analit tidak berwarna  Detektor
Kesulitan penghitungan kadar  integrator
KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka
untuk menjawab kekurang-kekurangan tersebut

Injector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan

robotik injektor, sangat volumetrik
Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik
Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil,
tekanan dapat dibuat besar  Hasil pemisahan baik
Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)
Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung AuC 
mudah penghitungan kadar 

Sehingga disebut: Kinerja Tinggi

 BAGAN SISTEM KCKT

detektor

kolom
injektor
pompa oven

Wadah
solven
integrator
WADAH FASE GERAK

Merupakan tandon berisi fase gerak

Mempunyai sistem penyaring
POMPA
Merupakan sistem agar fase gerak mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :
 Tekanan yang dihasilkan tinggi

 Fluktuasi tekanan rendah

 Kecepatan aliran fase gerak tepat
 INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke
dalam sistem KCKT

Pump Pump

Column

Column
[INJECT] [LOAD]
 Sistem sample loop injektor

posisi load Posisi inject

pompa kolom pompa kolom

sample loop
OVEN KOLOM – instrumen pemanas
Syarat :
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik
Kolom pada KCKT

> Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi

Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih
kompak, hasil pemisahan lebih baik
Dapat dipakai berulang
DETEKTOR HPLC

Yang umum dipakai

 Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
 Detektor Photodiode Array (PDA)
 Detektor Fluorescence (RF)
 Detektor Konduktivitas (CDD)
 Detektor Refraktive Indeks (RID)
 Detektor Elektrokimia (ECD)
 Detektor spektrometer massa
DETEKTOR SPEKTROFOTOMETER UV/VIS

Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul

pada panjang gelombang tertentu => tereksitasi elektronik

Eksitasi elektronik
kuvet
Ein Eout

l
Hk.Lambert-Beer
A= eCl = - log (Eout / Ein)
A= eCl = - log (Eout / Ein)
absorbansi

1 Kisaran linear

konsentrasi
Pemilihan pjg gelb.: quantitative / preparative?
275 nm
208 nm

275 nm
208 nm
Detektor Photodiode Array

Sample Cell Grating

satu elemen dapat
Mendeteksi absorban
D2 / W lamp
Pada satu pjg gelb..

512 Elements Photodiode Array

Detektor Photodiode Array : Kromatogram 3D
Spektrum
kromatogram
Absorbansi

waktu
Detektor Photodiode Array
 Puncak dapat di identifikasi dengan spektrum UV.
 Pemeriksaan kemurnian puncak dapat dilakukan.
--overlap 3 spektrum
--rasio kromatogram
--perbandingan threshold dan similarity index.
Detektor Spektrofluoresen

Excitation Wavelength

+ hn1 *
* hn2+
A* Emission Wavelength
hn1 hn2
Fluorescence
A A
Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence
Reagen derivatisasi
Reagen OPA untuk amine primer
A
CHO
+ R-NH2 N-R
CHO A
o-phthalaldhyde
(OPA)
Reagen ADAM untuk asam lemak
+ R-COOH
CHN2 CH2OCOR
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
 Detektor Refraktive Indeks

Sistem optik
Detektor Refraktive Indeks
 BAGIAN DARI SISTEM HPLC

Kromatogram gula
 Analytical Conditions
 Column : Shim-pack CLC-
NH2
 Mobile phase : Acetonitrile /
water
=7/3
 Flow rate : 1.0 mL/min
 Temperature : Ambient
 Peaks
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
Detektor Konduktifitas
V K (conductivity) = I [A] / E [V]
I =A [cm2] / L [cm] * k
(k : specific conductivity)

A A k= (I/E)*(L/A)
L elektroda
Detektor Konduktifitas
 Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur.
 Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur
terkontrol
Kromatogram anion dalam air laut
 Analytical Conditions
 Column : Shim-pack IC-A3
 Mobile phase :
8.0 mM p-hydroxybenzoic acid
3.2 mM Bis-Tris *
 Flow rate : 1.5 mL/min
 Temperature : 40 C
 Injection Volume : 100 uL
 Peaks
 1. F (1.4 ppm)
 2. Cl (10200 ppm)
 3. NO2 (10 ppm)
 4. Br (43 ppm)
 5. NO3 (44 ppm)
 6. SO4 (431 ppm)
Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
Perbandingan detektor
UV/ VIS RF RID CDD ECD
LOD 10 ppb 10 ppt 100 ppb 10 ppb 100 ppt
GC Yes Yes No No No

LOD : Limit deteksi (S/N=3)

GC : Gradient Compatibility
Kesimpulan

 Dengan menggunakan metode

KCKT/HPLC kita dapat mengetahui
penetapan suatu obat atau bahan obat
dengan kualitas hasil yang lebih baik di
banding metode lainnya.
Daftar pustaka
 Gandjar, I. G. & Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi
Analisis. Cetakan Pertama. Yogyakarta:Pustaka
Pelajar.
 Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. (2014).
Farmakope Indonesia. (edisi V). Jakarta:
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.
 Jhon, S.D. (2010). Statistik farmasi. Penerjemah: Dr.
H. Harrizul Rivai, MS. Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran (EGC).