Gram Staining di

Clinical Microbiology
Noda Gram ditemukan oleh dokter Denmark,
Hans Christian Gram, saat bekerja di Berlin
pada tahun 1883. Dia kemudian menerbitkan
prosedur ini pada tahun 1884. Pada saat itu, Dr
Gram sedang belajar bagian jaringan paru-paru
dari pasien yang telah meninggal karena
pneumonia
Lembaran Pertama Gram Staining

Dalam makalahnya, Dr Gram menggambarkan

bagaimana ia mampu memvisualisasikan apa yang
sekarang kita sebut Staphylococcus, Streptococcus,
Bacillus, dan Clostridia di bagian histologis berbagai.
Menariknya, Dr Gram tidak benar-benar menggunakan
safranin sebagai counter stain dalam prosedur asli (Gram
sel negatif akan berwarna). Dia malah disarankan
menggunakan Bismarck coklat sebagai counter stain
untuk mengaktifkan jaringan inti sel yang akan
divisualisasikan.
Jerman patolog Carl Weigert (1845-1904) dari
Frankfurt, menambahkan langkah akhir
pewarnaan dengan safranin
 Metoda of Gram stain

Sebuah metode pewarnaan bakteri menggunakan violet noda.

Karakteristik pewarnaan gram (dilambangkan sebagai positif
atau negatif). Bakteri tetap diwarnai dengan kristal violet
(metil violet), perlakukan dengan 3% Iodine atau larutan
kalium iodida, kemudian dicuci dengan alkohol. Metode
tersebut membedakan bakteri menjadi dua kelas utama, gram
positif dan gram negatif
Perbedaan Dinding Sel Gram
Positive – Gram Negative
Gram positif tidak boleh keliru
• Dalam teknik Stain Gram, dua pewarna
bermuatan positif digunakan: kristal violet dan
safranin. Penggunaan penunjukan "gram
positif" tidak harus bingung dengan konsep
pewarnaan sel dengan noda sederhana yang
memiliki muatan positif.

Rendahnya kualitas slide Bisa dikoreksi

Penggunaan slide kaca yang belum dibersihkan atau pra

degreased?

CATATAN: Menyimpan slide dalam botol dengan etanol 95%

akan memastikan slide bersih. Tiriskan alkohol berlebih atau
slide api sebelum digunakan.
Empat Langkah-langkah dalam Pewarnaan Gram

Ada empat langkah dasar dari pewarnaan Gram, yang meliputi :

1.Stain primer, violet kristal atau Methyl sebagai kultur bakteri
2.Penambahan mordant (Iodine) mordant,
3.Penghilang warna cepat (decolorization), dengan alkohol atau aseton
4.Counterstaning dengan Safranin
 Pengolesan
• Pertama-tama siapkan slide. Kemudian
tempatkan bakteri pada slide dengan setetes
air, kemudian panaskan yang memungkinkan
mereka untuk kering

Persiapan Preparasi
persiapan pengolesan yang tepat harus
menghasilkan monolayer organisme cukup
padat untuk visualisasi, mudah tapi cukup tipis
untuk mengungkapkan karakteristik dan
morfologi. Gunakan slide yang baru dan bersih

CATATAN: Ketika mengunakan pipet atau swab

yang sama, selalu inokulasi culture media
pertama
Metode Pengolesan Material
BENAR
SALAH
Proses Pewarnaan Gram

1.Pada rak, basahi dengan kristal violet (Methyl violet) selama 10 sec
2.Bilas sebentar dalam air untuk menghilangkan kristal violet
3.Basahi dengan Iodine selama 10 sec
4.Bilas sebentar dalam air, jangan sampai bagian mengering.
5.Penghilang warna (Decolourise) dengan aseton selama beberapa detik (<
6 sec)
6.Segera bilas dalam air keran
7.Counterstain dengan safranin selama 15 sec
Step 1
Step 2
Step 3
Step 4
Step 5
Step 6
Step 7
Hal yang Perlu Diperhatikan
dalam Gram Staining

Langkah yang paling penting dari pewarnaan

gram adalah langkah dekolorisasi sebagai stain
kristal violet akan dihapus dari Gram Positive
dan Gram Negative jika pada decolorizing
(misalnya alkohol) yang tersisa terlalu lama.
 Hati-hati Dalam Penggunaan
Aseton

1.Aseton adalah decolorizes cepat daripada alkohol dan harus

digunakan dengan hati-hati.
2.Dekolorisasi yang berlebihan ternyata memunculkan bentuk
Gram positif sebagai Gram negatif
Faktor Penentu Pewarnaan
Gram
Termasuk pada umur culture, media, suasana inkubasi, metode
pewarnaan. Pertimbangan yang sama berlaku untuk pap
(pengolesan) dari spesimen klinis, dan faktor-faktor tambahan
termasuk jenis sel inang yang berbeda serta kemungkinan dari
fagositosis

Kita tahu bahwa hanya sel-sel utuh adalah Gram-positif, sehingga

sel-sel lembut yang rusak menjadi Gram-negatif. Pengamatan
menunjukkan bahwa bakteri protoplama, tanpa dinding sel,
masih tetap Gram-positif,. Hal tersebut menunjukkan bahwa
kemungkinan membran semipermeabel yang entah bagaimana
terlibat dalam reaksi.
 Bagaimana Kerja Pewarnaan
Stain
Pada bakteri Gram-positif, stain kristal violet ungu tua
dipertahankan oleh lapisan tebal pada peptidoglikan yang
membentuk lapisan luar sel.

Pada bakteri Gram-negatif, lapisan peptidoglikan tipis di

periplasma tidak mempertahankan stain gelap, dan counterstains
safranin pink pada lapisan peptidoglikan.
Sebuah pewarnaan suspensi bakteri mengandung campuran
Gram negatif bacili, dan Gram positif cocci diatur dalam
kelompok (Staphylococcus spp)