Anda di halaman 1dari 33

HPLC/KCKT

(High Performance Liquid


Chromatography/Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi )
Oleh:
Sandra Tri Juli Fendri, M.Si
Suatu metoda analisa kuantitatif dan kualitatif
dengan memisahkan suatu senyawa
mengunakan fase gerak berupa cairan yang
dialirkan dengan tekanan tinggi melalui kolom
sebagai fase diamnya.
Bisa untuk analisa kualitatif dan
kuantitatif.

Waktu analisa yang diperlukan


lebih pendek

Keuntungan Kolom dapat digunakan berkali-


kali
HPLC
Detektor KCKT dapat
divariasikan dan banyak jenisnya

Mudah dioperasikan secara


otomatis
Diagram Instrumentasi HPLC
(Sistem peralatan HPLC)
Varian HPLC System

9060 Polychrom Computer


(Diode Array) Detector Workstation

9050 Variable
9010 Solvent UV/Vis Detector
HPLC Solvent Delivery System
Reservoirs

Rheodyne
Injector
Keep an eye on
HPLC these 4 screens!
Colum
n
Varian Solvent Delivery
System
%A %B %C Flow Rate Pressure to column
{H2O} {MeOH} (mL/min) (atmos.)
load

Ready
inject

Rheodyne
Injector
Varian 9010 Solvent Delivery System to injector

through pump

Column
through C
pulse
dampener
A B

from solvent to
Ternary Pump reservoir detector
Wadah
Fase Gerak
Untuk menampung fase gerak yang
digunakan selama proses
pemisahan/analisis dengan KCKT

Wadah ini harus bersih dan lembam (inert)

Bahan yang umum digunakan adalah gelas


dan baja anti karat

Biasa nya bisa menampung 1-2 Liter Fase


gerak

Degassing
Kriteria pemilihan Fase Gerak

Toksisitas
Viskositas

Indeks Bias

Transparansi
Terhadap UV
Harga
Lembam
(inert)
Syarat-syarat fase gerak pada sistem KCKT

Harus murni secara kimia

Harus bebas dari gas

Harus bebas dari partikel-partikel kecil

Tidak bereaksi dengan pengamas kolom


(inert)
Dapat melarutkan sampel dengan
baik

Viskositas rendah
Teknik Elusi Fase Gerak

Isokratik Gradien

elusi dilakukan dengan


elusi dilakukan dengan satu
campuran fase gerak yang
macam atau lebih fase gerak
perbandingannya berubah-
dengan perbandingan tetap
ubah dalam waktu tertentu
(komposisi fase gerak tetap
(komposisi fase gerak
selama elusi).
berubah-ubah selama elusi).
teknik elusi menggunakan
teknik elusi menggunakan
komposisi fase gerak tetap
komposisi fase gerak yang
(polaritas tetap) selama
berubah-ubah (polaritas
proses kromatografi
berubah) selama proses
berlangsung
kromatografi berlangsung
Sistem Injektor

Autoinjektor
stop flow

Septum Katup putaran


(loop valve)
Stop flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja
atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan
lagi.

Septum
Septum yang digunakan pada KCKT sama
dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas.
Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
sampai 60 -70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua
pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil
dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
Katup putaran (loop valve)

Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk


menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan
dilakukan dengan cara automatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang
lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
Sejumlah volume sample (dalam solvent) disuntikkan ke
dalam loop dalam posisi “load”, sampel masih berada di
dalam loop
- Kran diputar (ke bawah) utk mengubah ke posisi “injeksi”
dan fasa gerak membawa sample ke dalam kolom
Autoinjektor
Kolom
Pompa Kromatografi

Kolom Kolom
Pompa dengan Analitik Preparatif
Tekanan konstan
Diameter dalam umumnya
2 -6 mm. memiliki
Panjang kolom diameter 6 mm
tergantung pada atau lebih besar
Pompa dengan aliran
jenis material dan panjang
fase gerak yang
pengisi kolom kolom 25 -100
konstan
cm.
Tipe-Tipe Kolom
HPLC
Conventional
Column
Mikro Column
Makro
HPLC Column
PUmp

Small Bore Packed Open


Packed Capillary tubular
Colomn Column kolumn

Microfeeder
Pump
Flow Rate
Id (Inner Sample
Tipe kolom Lenght (Mobile
Diameter) Capsity
Phase)

Convention
4,6 mm 10-25 cm 1 mL/min 10-100µg
al Column

Small Bore
Packed 0,2-1 mm 1-10 cm 1-20µL/min 1-10µg
Column

Packed
capillary 40-80µm 1-100 cm 0,5-2µL/min 1µg-100 ng
Column

Open
Tubular 15-10µm 1-100 cm ˂ 1µL/min ˂100 ng
Column
Detektor pada HPLC

Detektor Detektor
Universal spesifik
Detektor yang mampu detektor yang spesifik yang
mendeteksi zat secara hanya akan mendeteksi
umum, tidak bersifat analit secara spesifik dan
spesifik, dan tidak bersifat selektif
selektif

detektor indeks bias dan detektor UV-Vis, detektor


detektor spektrometri fluoresensi
massa
Syarat Detektor Yang Baik :

 Respons Universal dan dapat diaplikasikan untuk semua


analit
 Sensitivitas tinggi.
 Noisy rendah
 Memiliki kisaran linear yang dinamis.
 Respon tidak dipengaruhi oleh variasi parameter (
misalnya : suhu, tekanan, dan kecepatan alir )
 Respons tidak dipengaruhi oleh komposisi fase gerak
 Mudah digunakan dan dapat dipercaya
 Tidak merusak sampel
 Tidak mahal (harga, biaya operasi, dan perawatan)
 Respon stabil untuk jangka waktu yang lama
 Mampu memberikan kualitatif mengenai analit
 Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan
reprodusibel
Jenis-jenis detektor HPLC :

Detektor
serapan optis
Detektor UV
Photodiode MS
Array

Detektor
Hamburan
Detektor Cahaya
Indeks Bias Detektor Evaporasi
Elektrokimia

Detektor Detektor Detektor


Fluoresensi Ionisasi Radioaktif
Nyala
Detektor UV

 Detektor yang didasarkan pada adanya


peneyerapan radiasi UV dan sinar tampak
 Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana
pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut
sedangkan cuplikan menyerap dengan kuat.
 Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan satu
panjang gelombang (254 nm) dan detektor
dengan λ yg dapat diubah ubah antara 200-700
nm
 Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar
 Detektor ini hanya bekerja jika senyawa
mempunyai kromofor
Detektor PDA

Mampu memberikan kumpulan kromatogram


secara simultan pada panjang gelombang yg
berbeda dlm sekali proses (single run)
Pada kromatogram dapat pula ditampilkan
spektrum UV shg dpt digunakan untuk
memilih λmaks utk sistem HPLC
Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan
ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi,
panjang gelombang, dan waktu)
Detektor Photodiode Array : Kromatogram
3D
Spektrum
Absorbansi

kromatogram

waktu
Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias ( Refractive index detector,RID)


menunjukkan respon terhadap perubahan dari indeks bias yang
disebabkan cuplikan.
- Sensitifitas sangat rendah bila dibandingkan detektor lain.
- Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir

Detektor Fluoresensi

- Digunakan untuk komponen –komponen yang berfluoresensi


- Kepekaan dan selektifitas cukup tinggi
- Banyak digunakan dalam analisis bahan cairan biologis karaena
kepekaanya 100 kali lebih puka daripada detektor UV-Vis

Detektor Elektrokimia

- Electrochemical detektor (ECD).


- Deteksi bergantung pada sifat hantaran molekul zat terlarut.
- - Detektor ini relatif selektif karena hanya dapat mendeteksi
komponen polar
Detektor Ionisasi Nyala

Pada setektor ionisasi nyala (Flame ionization detector,FID). Pelarut


diuapkan setelah melewati kolom, kemudian dilewatkan pada
sumber lampu Ultraviolet dan nyala dideteksi.
Kelemahan detektor ini terletak pada batas deteksinya yang hanya
sekitar 1 µg

Detektor hamburan cahaya evaporasi


Detektor hamburan cahaya evaporasi ( evaporation light scattering
detector, ELSD), pelarut diuapkan setelah melawati kolom, kemudian
kemudian komponen yang tersisa di evaporasi sebagai molekul
partikel. Semua komponen dapat dideteksi dengan detektor ini.

Detektor Radioaktif

Selektifitas tinggi karena hanya mendeteksi zat yang memeancarkan


radiasi.
Detektor ini memiliki kemampuan besar untuk mengkaji nasib obat
dan penimbunanan senyawa dalam hewan percobaan.
Normal vs. Reversed Phase Chromatography

Normal Phase Reversed Phase


Stationary phase Polar (silica gel) Non-polar (C18)
Non-polar Polar
Mobile phase
(organic solvents) (aqueous/organic)
Sample movement Non-polar fastest Polar fastest
Different polarities Different
Separation based on
(functionality) hydrocarbon content
Standar

Sampel

Anda mungkin juga menyukai